第10章基因分析的基本策略(參考版)
2025-03-10 01:08本頁面
【正文】 2023年 3月 26日星期日 8時(shí) 38分 1秒 20:38:0126 March 2023 1一個(gè)人即使已登上頂峰，也仍要自強(qiáng)不息。 2023年 3月 26日星期日 下午 8時(shí) 38分 1秒 20:38: 1最具挑戰(zhàn)性的挑戰(zhàn)莫過于提升自我。勝人者有力，自勝者強(qiáng)。 :38:0120:38Mar2326Mar23 1越是無能的人，越喜歡挑剔別人的錯(cuò)兒。 , March 26, 2023 閱讀一切好書如同和過去最杰出的人談話。 2023年 3月 26日星期日 8時(shí) 38分 1秒 20:38:0126 March 2023 1空山新雨后，天氣晚來秋。 2023年 3月 26日星期日 下午 8時(shí) 38分 1秒 20:38: 1楚塞三湘接，荊門九派通。 20:38:0120:38:0120:38Sunday, March 26, 2023 1不知香積寺，數(shù)里入云峰。 20:38:0120:38:0120:383/26/2023 8:38:01 PM 1成功就是日復(fù)一日那一點(diǎn)點(diǎn)小小努力的積累。 下午 8時(shí) 38分 1秒 下午 8時(shí) 38分 20:38: 沒有失敗，只有暫時(shí)停止成功！。 2023年 3月 下午 8時(shí) 38分 :38March 26, 2023 1行動(dòng)出成果，工作出財(cái)富。 :38:0120:38:01March 26, 2023 1他鄉(xiāng)生白發(fā)，舊國見青山。 :38:0120:38Mar2326Mar23 1故人江海別，幾度隔山川。 , March 26, 2023 雨中黃葉樹，燈下白頭人。 ? 免疫組化將免疫反應(yīng)的 特異性 、組織化學(xué)的 可見性 和顯微鏡的 顯像和放大作用 巧妙地結(jié)合起來，成為蛋白質(zhì)水平分析基因的直觀特異的方法之一。 ? 對轉(zhuǎn)染細(xì)胞的外源基因表達(dá)情況也可以采用此法。是一種快速定量分析細(xì)胞的新技術(shù)。 ? 基本過程 ：蛋白質(zhì)樣品制備和 SDSPAGE分離； 蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)膜； 標(biāo)記的抗體與膜上蛋白質(zhì)的抗原抗體雜交； 檢測并分析標(biāo)記物信號。上必須選用蛋白質(zhì)技術(shù)對基因的表達(dá)活性進(jìn)行分析。 ?目前在 研究轉(zhuǎn)基因的活性。 ? 特點(diǎn)：能在同一時(shí)間內(nèi)平行分析大量的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，進(jìn)行大量的信息篩選和檢測分析。 ? 監(jiān)測大量基因表達(dá)的最好方法之一是 cDNA微陣列技術(shù)，利用這種技術(shù)可以同時(shí)測定成千上萬個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄活性。 ，同時(shí)檢測多個(gè)基因，可評價(jià)他們在同一情況下的差異表達(dá)。 RPA有 Northern Blot無法比擬的優(yōu)勢： ，反應(yīng)更加完全。 （二） RTPCR用于定性、定量分析 RNA 三、 RNA酶保護(hù)試驗(yàn) — 了解基因轉(zhuǎn)錄后的選擇性剪接 ?RNA酶保護(hù)試驗(yàn) ：可用于① mRNA定量、 ② mRNA末端定位、 ③ mRNA剪切部位④確定內(nèi)含子在相應(yīng)基因中的位置。 ? 將陽性參照基因作為內(nèi)參照與待測 RNA在一個(gè)反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，可以對 RNA進(jìn)行 相對定量分析 。其基本程序是：提取細(xì)胞總 RNA，然后將其中的mRNA在體外逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，再以 cDNA為模板，進(jìn)行特定基因的 PCR擴(kuò)增。同時(shí)作為監(jiān)測細(xì)胞內(nèi) RNA含量不夠準(zhǔn)確，只能作為 定性分析 RNA方法 。原理同 Southern blot。 ? mRNA研究常用的方法有 Northern blot、 原位雜交 、實(shí)時(shí) PCR、 RNA酶保護(hù)試驗(yàn) 、 cDNA芯片技術(shù) 和 RTPCR。目前在上述 RNA研究中，以 mRNA研究最為熱點(diǎn)。 （五） 顯示 ：根據(jù)核酸探針標(biāo)記物的種類分別進(jìn)行放射自顯影或利用酶檢測系統(tǒng)進(jìn)行不同顯色處理。 （三） 雜交 ：調(diào)整探針的濃度（ ～ ） 、探針長度（ 50～ 100個(gè)堿基）、雜交的溫度和時(shí)間。最常用的固定劑是多聚甲醛，其它的固定劑（如戊二醛）。放射性同位素標(biāo)記探針具有放射性既污染環(huán)境，又對人體有害，且受半衰期限制等缺點(diǎn)，非放射性探針可以用生物素、地高辛 、熒光素標(biāo)記探針。同時(shí)原位雜交既可檢測 DNA，也可檢測 RNA，所用探針不同而已。 ? 原位雜交不需要從組織提取核酸，對組織中含量極低的靶序列有 很高的靈敏度 ，并可 完整保持組織與細(xì)胞形態(tài) ，更能準(zhǔn)確反映出組織細(xì)胞的相互關(guān)系及功能狀態(tài)。 ? 利用人類基因組序列預(yù)測并設(shè)計(jì)了能與代表性片段雜交的寡核苷酸探針，制成芯片，然后與 RDA篩選出來的代表性差異 PCR產(chǎn)物在芯片上進(jìn)行雜交，用計(jì)算機(jī)分析雜交結(jié)果。 ?實(shí)時(shí) PCR需要包括熱循環(huán)儀、計(jì)算機(jī)、光學(xué)儀器用于熒光激發(fā)和收集器、數(shù)據(jù)處理和分析軟件。 ? 當(dāng) PCR產(chǎn)物擴(kuò)增時(shí)，聚合酶遇到結(jié)合在模板上的熒光探針時(shí)，利用聚合酶所具有的 5`3`外切酶作用，將兩種染料分離，因此根據(jù)報(bào)告熒光所發(fā)射的熒
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