第10章基因分析的基本策略-文庫(kù)吧資料
2025-03-12 01:08本頁面
【正文】 光強(qiáng)度與被切探針成正比，由此可以計(jì)算出 PCR產(chǎn)物的含量。 ? 在寡核苷酸探針的 5`端標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光染料 ， 3`端標(biāo)記一個(gè)猝滅染料 。 （ 3）實(shí)時(shí) PCR用于基因拷貝數(shù)分析 ? 實(shí)時(shí) PCR原理是：在 PCR反應(yīng)體系中加入一種雙色熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針，并根據(jù)探針上熒光信號(hào)的變化計(jì)算模板 DNA含量。 ? 當(dāng) PCR產(chǎn)物積累后，產(chǎn)物的復(fù)性可以競(jìng)爭(zhēng)引物與模板的結(jié)合，產(chǎn)物增加減慢，最后進(jìn)入平臺(tái)期。 將兩組 PCR產(chǎn)物片段群用 限制性內(nèi)切酶酶切 ,形成平均長(zhǎng)度 256bp的長(zhǎng)度； 將接頭消化 , 在 tester組末端接上新的接頭 ,tester組和driver組按 1:100比例混合，過量的 driver可與 tester中互補(bǔ)的部分形成雙鏈； 復(fù)性 , 按新接頭序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行第 2輪 PCR，只有tester和 tester雜合體才能和引物配對(duì) , 大量擴(kuò)增； ? 實(shí)時(shí) PCR根據(jù) PCR反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)設(shè)計(jì)的分析方法。 ? 差異顯示 PCR方法仍然存在幾個(gè)難以解決的問題： (1)重復(fù)率低，至少有 20%的差異條帶不能被準(zhǔn)確重復(fù)； (2)假陽性率可以高達(dá) 90%； (3)獲得的差異表達(dá)序列極少包含編碼信息。 ? 這樣構(gòu)成的引物對(duì)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增能產(chǎn)生出 20230條左右的 DNA條帶，其中每一條都代表一種特定 mRNA種，這一數(shù)字大體涵蓋了在一定發(fā)育階段某種細(xì)胞類型中所表達(dá)的全部 mRNA。 近年來，隨著 PCR技術(shù)的不斷改進(jìn)，如差異顯示PCR和實(shí)時(shí) PCR的發(fā)明，可以用于基因拷貝數(shù)的分析。 PCR反應(yīng)體系： 耐熱的 Taq DNA聚合酶、化學(xué)合成的寡聚核苷酸引物、4種 dNTP、以及合適的緩沖液體系。參與復(fù)制的有多種因素。 探針序列的選擇和探針信號(hào)的選擇。 （ 7） 雜交結(jié)果的檢測(cè) ： 采用核素標(biāo)記的探針或發(fā)光劑標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交時(shí)，在雜交洗膜后，將濾膜和X線片裝入暗盒，感光后，經(jīng)沖洗，在 X線片上可見黑色條帶。 （ 5）已知序列的 DNA探針的制備 （ 6） Southern雜交 ： 在將固定于膜上的 DNA片段與探針進(jìn)行雜交前，必須先進(jìn)行一個(gè) 預(yù)雜交 的過程。 固定支持物 ：硝酸纖維素（ NC）膜、尼龍膜、化學(xué)活化膜和濾紙等。 變性通常用堿變性法。 （ 3） 凝膠中核酸的變性 ： DNA在制備與電泳過程中DNA片段始終保持雙鏈結(jié)構(gòu)。 Southern blot步驟 （ 1） 待測(cè)核酸樣品的制備 ：提取基因組 DNA，并用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化水解基因組 DNA，成大小不一的 DNA片段。 DNA序列測(cè)定的意義 分析基因拷貝數(shù)變化 一、 Southern blot 檢測(cè)基因拷貝數(shù)變化 Southern blot 印跡雜交是指 DNA與 DNA的雜交，將電泳分離的待測(cè) DNA片段轉(zhuǎn)印并結(jié)合到一定的固定支持物上，然后用標(biāo)記的 DNA探針檢測(cè)待測(cè) DNA的一種方法。 通過 DNA序列分析，可以鑒定分析人工重組的基因。 揭示基因和基因組一級(jí)結(jié)構(gòu)變化在醫(yī)學(xué)研究中具有重要意義。（用熒光染料結(jié)合引物）。存在操作步驟繁瑣、效率低、速度慢的缺點(diǎn)，特別是讀結(jié)果的讀片過程。 化學(xué)裂解法（ MaxamGilbert） 1977 反應(yīng)體系 堿基修飾 堿基修飾 主鏈斷裂 斷裂點(diǎn) 試劑 反應(yīng) 試劑 G 硫酸二甲酯 鳥嘌呤甲基化 六氫吡啶 G G+A 甲酸 脫嘌呤作用 六氫吡啶 G/A C+T 肼 嘧啶開環(huán) 六氫吡啶 C/T C 肼（加鹽） 胞嘧啶開環(huán) 六氫吡啶 C 在化學(xué)修飾反應(yīng)中，通過控制反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間，只有一小部分堿基被修飾，隨后進(jìn)行斷裂反應(yīng)也是定量。 ?結(jié)果判讀 ，從放射性 X光底片上，直接讀出 DNA的核酸順序。 ?變性膠電泳 分離反應(yīng)混合物。對(duì)這 4組核苷酸鏈進(jìn)行高分辨變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，就可讀出序列。 ? 如果在 DNA的合成反應(yīng)中，加
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