基因功能分析的基本策略課件-文庫(kù)吧資料
2025-02-12 10:42本頁(yè)面
【正文】 擴(kuò)增出預(yù)期大小的片段。 打靶載體的正篩選 tk1 HB1 neor HB2 tk2 載體 載體 同源重組 neor G418正篩選，細(xì)胞存活 染色體 染色體 打靶載體的負(fù)篩選 tk1 HB1 neor HB2 tk2 染色體 染色體 非特異性整合 GCV負(fù)篩選，細(xì)胞死亡 PCR 鑒定 ?在打靶載體的 HB1 和 HB2 之間，加上一個(gè)載體和鼠的基因組中都沒(méi)有的獨(dú)特 DNA 序列（ US）。 ?編碼抗 G418 的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（ neor基因）。 1. 打靶載體的構(gòu)建 同源基因片段 質(zhì)粒載體 HB1 HB2 neor基因 HSVtk基因 2. 打靶載體導(dǎo)入 ES細(xì)胞 ? 磷酸鈣 DNA 共沉淀法 ? 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法 ? 電穿孔法 ? 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法 ? 顯微注射法 打靶載體的正 負(fù)選擇 ?與整合位點(diǎn)兩端區(qū)域同源的兩段 DNA 序列(HB1和 HB2)。 ?胚泡植入假孕小鼠的子宮。 ?打靶載體導(dǎo)入 ES 細(xì)胞及其鑒定。 ? 基因敲入 (gene knockin): 定向?qū)⒁欢位蛐蛄刑娲硪欢位蛐蛄小? ?核移植技術(shù)（ Nuclear Transfer) 核移植技術(shù)（ Nuclear Transfer) 第二節(jié) 基因打靶 ? 基因打靶 (Gene Targeting) ：通過(guò) DNA 定點(diǎn)同源重組，改變基因組中的某一特定基因，在生物活體內(nèi)研究此基因的功能。 動(dòng)物的克隆 ?1996 年，首次實(shí)現(xiàn)動(dòng)物的無(wú)性生殖。 ?β乳球蛋白 ?紅細(xì)胞生成素 ?凝血因子 VIII ?凝血因子 IX ?生長(zhǎng)激素 轉(zhuǎn)基因改良移植器官 ?改造異種來(lái)源器官的遺傳性狀，使之適應(yīng)于人體器官或組織的移植。 利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白 ?轉(zhuǎn)基因動(dòng)物反應(yīng)器：乳腺、膀胱、血液生物反應(yīng)器等。 ?轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型提供了人類疾病的研究手段。 人類疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型 ?完整的動(dòng)物模型可以模擬人類疾病的起始和發(fā)展，幫助了解疾病的病因和發(fā)展過(guò)程。 ? 建立人類疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。 ? 蛋白水平：轉(zhuǎn)基因的蛋白質(zhì)的表達(dá)以及功能檢測(cè)。 4）精子載體法 外源 DNA 精子 卵細(xì)胞 受精卵 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 共育法 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法 電穿孔法 DNA 精子 受精卵 DNA 卵細(xì)胞 DNA 胚胎干細(xì)胞 DNA 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染 磷酸鈣 DNA共沉淀法 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法 電穿孔法 四細(xì)胞胚胎 囊胚 原腸胚 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 微注射 顯微注射 3. 下游 — 基因整合與表達(dá)檢測(cè)及篩選 ? 染色體基因水平：是否整合了外源基因以及整合的位點(diǎn)和拷貝數(shù)。 ?反轉(zhuǎn)錄病毒載體容量有限，只能轉(zhuǎn)移小片段DNA(＜ 10kb)。 3）逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法 ?逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建 ?獲得四 /八細(xì)胞胚胎 /囊胚 /原腸胚 ?外源 DNA 導(dǎo)入早期胚胎： 獲得病毒顆粒感染早期胚胎 包裝細(xì)胞與早期胚胎共培養(yǎng) ?感染后的胚胎植入受體動(dòng)物子宮，發(fā)育成攜帶外源基因的動(dòng)物。 ? ES 細(xì)胞在體外培養(yǎng)，外源 DNA 導(dǎo)入后可用正 負(fù)選擇法篩選擇正確整合的 ES 細(xì)胞 , 相對(duì)較簡(jiǎn)單。 ? 定點(diǎn)整合位點(diǎn)必須在基因組的可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的地方。 胚胎干細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 胚泡 培養(yǎng)皿中分離胚泡內(nèi)層細(xì)胞 胰蛋白酶消化解離 加飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng) 胚胎干細(xì)胞 胚胎干細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 胚胎干細(xì)胞外源 DNA 的導(dǎo)入 DNA 胚胎干細(xì)胞 囊胚 原囊胚
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