基因功能分析的基本策略-碩士-文庫(kù)吧資料
2025-01-24 15:04本頁(yè)面
【正文】 體法 )： Target gene： cmyc n 查找靶基因 mRNAn 利用網(wǎng)絡(luò)在線支持，尋找 siRNA序列n 根據(jù)查找的 siRNA序列，合成長(zhǎng)鏈 oligon 構(gòu)建載體n 轉(zhuǎn)染n 檢測(cè)效應(yīng)（包括干擾效應(yīng)和生物學(xué)效應(yīng)）檢索文獻(xiàn)獲取有實(shí)驗(yàn)證明有效的靶點(diǎn)序列（核對(duì)）目的基因 mRNA獲取 ：載體構(gòu)建： dsDNA形成：退火 載體的酶切和回收 連接 轉(zhuǎn)化 鑒定轉(zhuǎn)染 ： 瓶頸之一 含有真核細(xì)胞篩選標(biāo)志 含有熒光標(biāo)志效應(yīng)檢測(cè) ： mRNA水平和蛋白水平兼顧(a) (b)24體外轉(zhuǎn)錄成本適中，省時(shí)，適用于篩選靶點(diǎn)序列不適用于長(zhǎng)期的研究或者針對(duì)某個(gè)特定靶點(diǎn)序列的大量研究長(zhǎng)片斷 dsRNA酶解法dsRNA在體外被 RnaseⅢ 家族成員切割成 siRNA不需要驗(yàn)證篩選多個(gè)靶點(diǎn)序列不適用于長(zhǎng)期研究或者特定siRNA序列的研究siRNA表達(dá)質(zhì)?；蛘卟《据d體在細(xì)胞中表達(dá) siRNAs AAACCAGCAGAACGTGTACGA 載體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)表達(dá) siRNAPCR制備的 siRNA表達(dá)框在細(xì)胞中表達(dá) 類降解 siRNAsiRNA制備常用的五種方法 ：化學(xué)合成體外轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)片斷 dsRNAs經(jīng) RNase在線技術(shù)支持的公司（網(wǎng)站） 庫(kù)等進(jìn)行 BLAST比較RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物RISC對(duì)靶 mRNA的切割是以內(nèi)切的方式進(jìn)行的，而且切割僅發(fā)生在與 siRNA同源的部分。反復(fù)篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。外源能作為一種游離體存在。天。 磷酸鈣法磷酸鈣法 將待轉(zhuǎn)染的 DNA溶解在磷酸緩沖液中，使 DNA片段與磷酸鈣共沉淀并形成大的顆粒；加入貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞中被吸收，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因。 顯微注射法顯微注射法 將外源 DNA在顯微操作系統(tǒng)的輔助下，直接將外源 DNA注入哺乳動(dòng)物受精卵的原核內(nèi)，使外源基因整合到基因組上，制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。 轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染技術(shù) 脂質(zhì)體法脂質(zhì)體法將待轉(zhuǎn)染的 DNA溶液與磷脂混合，形成脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)，將脂質(zhì)體懸液加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，與受體細(xì)胞膜發(fā)生融合， DNA片段隨即進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)。rebinationOverexpressionAntisenseRNAi抑制基因表達(dá)觀察功能變化KnockOut 法Antisense法 Ribozyme法RNAi法RNA干擾技術(shù)基因敲除技術(shù)基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型基因功能分析的基本策略將某一基因從動(dòng)物基因組中剔除或?qū)⑼庠椿蛞雱?dòng)物基因組產(chǎn)生經(jīng)過(guò)基因工程修飾（改造）的動(dòng)物實(shí)現(xiàn)在整體和細(xì)胞水平認(rèn)識(shí)基因的功能第一節(jié) 轉(zhuǎn)基因技術(shù)transgenic technology將外源基因?qū)胧芫鸭?xì)胞或胚胎干細(xì)胞中通過(guò)外源基因與細(xì)胞染色體 DNA之間
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