【文章內(nèi)容簡介】 。誘變劑引起 DNA分子的大損傷，導(dǎo)致染色體結(jié)構(gòu)上的缺失、重復(fù)、插入、易位和倒位等變化和染色體數(shù)目的改變。誘變劑：216。 理化因子： Xray、烷化基、亞硝酸、秋水仙素。216。 生物因子如轉(zhuǎn)座子2. 自發(fā)突變 指生物體在無人工干預(yù)下自然發(fā)生的低頻率突變自發(fā)突變的原因：216。 由背景輻射和環(huán)境因素引起，如天然的宇宙射線等。216。 由微生物自身有害代謝產(chǎn)物引起，例如過氧化氫等。216。 由 DNA復(fù)制過程中堿基配對錯誤引起。堿基錯配頻率為 107~1010。（六）、 DNA損傷的修復(fù)紫外線對 DNA的損傷主要引起相鄰嘧啶發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)形成嘧啶二聚體（ TT、 TC、 CC）和水合物，造成局部 DNA分子無法配對，從而引起微生物的死亡或突變。DNA損傷類型很多，微生物對其修復(fù)的方法也各不相同 。1. 光復(fù)活作用（ photoreactivation）最早是 A． Kelner(1949年 )在 Streptomyces griseus (灰色鏈霉菌 )中發(fā)現(xiàn)。光復(fù)活作用：把經(jīng) UV照射后的微生物立即暴露于可見光下時，就可出現(xiàn)明顯降低其死亡率的現(xiàn)象。修復(fù)機(jī)理 在黑暗下， 嘧啶二聚體和 光解酶 (光裂合酶 )結(jié)合，形成 DNA— 酶復(fù)合物，在 300— 500nm可見光下，酶獲得光能激活，使二聚體重新分解成單體，同時，光解酶與復(fù)合物分解，重新執(zhí)行功能。 光解酶 (photolyase ):? 相對分子質(zhì)量為 104 (隨菌種不同而略有差異 )。? 含兩個輔助因子? FADH，? 8羥基脫氮核黃素或次甲基四氫葉酸 2. 切除修復(fù) (excisionrepair)又稱 暗修復(fù)（ darkrepair）不依賴可見光，通過酶切作用去除嘧啶二 聚體，重新合成一段正常 DNA鏈的修復(fù) 方式。暗修復(fù)的機(jī)理? ① 內(nèi)切核酸酶在胸腺嘧啶二聚體的 5’側(cè)切開一個 3’OH和 5‘P的單鏈缺口；? ② 外切核酸酶從 5’P至 3’OH方向切除二聚體，并擴(kuò)大缺口；? ③ DNA聚合酶以 DNA的另一條鏈為模板，從原有鏈上的3’OH端起逐個延長，重新合成一條缺失的 DNA鏈；? ④ 通過連接酶的作用，把新合成的寡核苷酸的 339。OH末端與原鏈的 539。P末端相連接，從而完成了修復(fù)作用。優(yōu)良菌種選育的意義：☆ 為 生產(chǎn) 提供了各種類型的 突變株 ，大大 提高 了菌種產(chǎn)生有利用價值代謝產(chǎn)物的水平，還可以 改進(jìn) 產(chǎn)品質(zhì)量， 去除 不需要的代謝產(chǎn)物或產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物☆ 另外，通過菌種選育可以 研究 菌種的分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)二、突變與育種經(jīng)典育種方法： 自然選育 、 誘變育種較定向的育種方法： 雜交育種 、 原生質(zhì)體 融合 、 基因工程優(yōu)良菌種選育的技術(shù)手段：（一）、自發(fā)突變育種 1. 選育微生物在自然以 106的突變率發(fā)生自發(fā)突 變。2. 定向培育定向培育利用微生物的自發(fā)突變，并采用特定的選擇條件，通過對微生物群體 不斷移植以選育出較優(yōu)良菌株方法。 如：卡介苗的培育（二） 、 誘變育種誘變育種是指利用誘變劑處理微生物細(xì)胞群，提高微生物的突變率，以便采用簡便、快速和高效的篩選方法，從中挑選出少數(shù)符合目的的突變株進(jìn)行育種的方法。 誘變育種的基本環(huán)節(jié) 誘變育種的一般步驟出發(fā)菌株培養(yǎng)液細(xì)胞或孢子懸液誘變處理平板分離 初篩 復(fù)篩 保藏及擴(kuò)大試驗純化、同步培養(yǎng)離心收集細(xì)胞，洗滌，制菌懸液，玻璃珠打散，過濾活菌計數(shù)，誘變預(yù)備試驗存活細(xì)胞計數(shù)，致死率計算變異率計算 誘變育種中的原則 （ 1） 選擇簡便有效的誘變劑 ? 化學(xué)誘變劑 :N甲基 N’ 硝基 N亞硝基胍 (NTG) ? 物理誘變劑 :紫外線為最簡便 ? 生物誘變劑 :溶原性噬菌體 （ 2）、 挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株 1) 生產(chǎn)中的自發(fā)突變菌株2) 具優(yōu)良性狀的菌株，如生長快、營養(yǎng)要求低等3) 已發(fā)生過突變的菌株4) 對誘變劑敏感性高的增變變異株（ 3）、處理單細(xì)胞或單孢子懸液 ? 容易分散，每個細(xì)胞可均勻接觸誘變劑 ? 防止長出不純菌落 產(chǎn)生菌落不純的原因：? 某些微生物細(xì)胞是多核的 ? 突變的性狀在當(dāng)代不表達(dá)產(chǎn)生表型 （ 4）、 選用最適的誘變劑量 ? 突變率隨劑量的增加先提高再下降。? 低劑量易發(fā)生正變，高劑量易出現(xiàn)負(fù)變? 多次誘變提高了產(chǎn)量的菌株更容易出現(xiàn)負(fù)變。 （ 5）、充分利用誘變劑復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng)復(fù)合處理方法216。同一誘變劑的重復(fù)使用216。兩種或多種誘變劑的先后或同時使用（ 6）、 利用和創(chuàng)造與產(chǎn)量相關(guān)的指標(biāo) （ 7）、 設(shè)計高效篩選方案 （ 8）、 創(chuàng)造新型篩選方法 突變株的篩選（ 1）、 產(chǎn)量突變株的篩選 根據(jù)突變株的產(chǎn)物特性來確定具體的篩選方法。 （ 2）、 抗藥性突變株的篩選 216。抗藥性基因是一種選擇性遺傳標(biāo)記，同時，有些抗藥菌株還是重要的生產(chǎn)菌種。216。梯度平板法是定向篩選抗藥性突變株的有效方法。（ 3）、營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選 1) 幾個概念基本培養(yǎng)基 (MM)： 僅能滿足某微生物的野生型菌株生長所需要的最低成分的組合培養(yǎng)基，稱基本培養(yǎng)基。不同微生物的基本培養(yǎng)基是很不相同的。完全培養(yǎng)基 (CM)： 凡可滿足一切營養(yǎng)缺陷型菌株營養(yǎng)需要的天然或半組合培養(yǎng)基，稱完全培養(yǎng)基。補(bǔ)充培養(yǎng)基 (SM)： 凡只能滿足相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型突變株生長需要的組合或半組合培養(yǎng)基稱補(bǔ)充培養(yǎng)基。? 野生型 (wildtype)： 從自然界中分離到的任何微生物在其發(fā)生人為突變前的原始菌株，稱野生型菌株，簡稱野生型。如 leu+? 營養(yǎng)缺陷型（ auxotroph）： 野生型菌株經(jīng)誘變劑處理后，由于發(fā)生了喪失某酶合成能力的突變，因而只能在加有該酶合成產(chǎn)物的培養(yǎng)基中才能生長的突變菌株。如 leu? 原養(yǎng)型（ prototroph）： 營養(yǎng)缺陷型突變菌株經(jīng)回復(fù)突變或重組后產(chǎn)生的菌株，其營養(yǎng)要求在表型上與野生型相同。如 leu+2) 營養(yǎng)缺陷型的篩選的程序與方法A. 誘變劑處理 B. 淘汰野生型：抗生素法或菌絲過濾法 216。 抗生素法：抗生素 (青霉素 )能抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的生物合成，可殺死能正常生長繁殖的野生型細(xì)菌但無法殺死 處于休止?fàn)顟B(tài)的營養(yǎng)缺陷型細(xì)菌。216。 菌絲過濾法：適用絲狀真菌和放線菌。其原理是在基本培養(yǎng)基中，野生型菌株的孢子能萌發(fā)成菌絲，而營養(yǎng)缺陷型的孢子則不能。將誘變劑處理后的孢子放在基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，過濾，重復(fù)數(shù)遍 ，可去除野生型菌株。C. 檢出缺陷型通常采用影印平板法D. 用生長譜法鑒定營養(yǎng)缺陷型生長譜法： 是指在混有供試菌的平板表面點加微量營養(yǎng)物，觀察營養(yǎng)物的周圍有否長菌來確定該供試菌的營養(yǎng)要求的方法。如某一營養(yǎng)物的周圍有生長圈，供試菌就是該營養(yǎng)物的缺陷型突變株。 生長譜法鑒定缺陷型 誘變育種的整個過程主要是 誘變和篩選的不斷重復(fù) ，直到獲得比較理想的高產(chǎn)菌株。 誘發(fā)突變是 使用誘變劑促使菌種發(fā)生突變 ，所以誘發(fā)所形成的突變與 菌種本身的遺傳背景 、 誘變劑種類及其劑量的選擇 和 合理使用方法 均有密切關(guān)系，這三者是誘變部分的關(guān)鍵所在。第三節(jié) 基因重組和雜交育種一、原核生物的基因轉(zhuǎn)移與重組原核生物的基因重組的特點為：216。片段性，僅一小段 DNA序列參與重組；216。單向性，即從供體菌向受體菌 (或從供體基因組向受體基因組 )作單方向轉(zhuǎn)移；216。轉(zhuǎn)移機(jī)制獨(dú)特而多樣，如接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)等。一 、轉(zhuǎn)化 (transformation)? 轉(zhuǎn)化 ：受體菌直接吸收供體菌的 DNA片段而獲得后者部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)化作用。? 轉(zhuǎn)化子 ：通過轉(zhuǎn)化方式而形成的雜種后代，稱轉(zhuǎn)化子 2．轉(zhuǎn)化微生物的種類? 原核微生物252。肺炎鏈球菌 Streptococcus pneumoniae252。嗜血桿菌屬 Haemophilus252。芽孢桿菌屬 Bacillus252。根瘤菌屬 Rhizobium252。假單胞菌屬 Pseudomonas252。黃單胞菌屬 Xanthomonas? 真核微生物v釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae()、v粗糙脈孢菌 Neurosporacrassav黑曲霉 Aspergillus niger (petence) 感受態(tài) 是指受體細(xì)胞最易接受外源 DNA片段并能實現(xiàn)轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)。? 兩個菌種或菌株間能否發(fā)生轉(zhuǎn)化，依賴于親緣關(guān)系 ,但是凡能發(fā)生轉(zhuǎn)化，受體細(xì)胞必須處于感受態(tài)。o 不同微生物感受態(tài)細(xì)胞出現(xiàn)的時期不同：如 S． Pneumoniae在 指數(shù)期后期， Bacillus o 不同微生物 感受態(tài)細(xì)胞在群體中占的比例不同如 枯草芽孢桿菌： 20％左右 流感嗜血桿菌： 100％o 不同微生物 感受態(tài)細(xì)胞維持感受態(tài)的時間不同 如 枯草芽孢桿菌感受態(tài)維持