【文章內(nèi)容簡介】 4，結(jié)果均為陰性，故 2： 2 膠體金標(biāo)記抗體，選擇 ％比例加入 A104, 并以 15181。g/ml 的抗體濃度進(jìn)行標(biāo)記結(jié)果符合要求。 2)檢測 ，出現(xiàn)假陰。建議加大檢測線包被濃 度，提高靈敏度，去除假陰。 第 10 頁 共 23 頁 檢測線包被濃度的確定 當(dāng) 噴膜量為 ， 將 抗 HBs 單克隆抗體 A 稀釋成不同濃度： 3mg/ml、 、 2mg/ml、 、 1mg/ml， 分別和 1mg/ml 的羊抗鼠 IgG 抗體同步噴涂硝酸纖維素膜。 用制備好的樣品墊、免疫金結(jié)合墊以及其它輔料依次粘貼制成試劑條，測試內(nèi)質(zhì)控靈敏度參考品，在 30分鐘內(nèi)判定結(jié)果，檢測結(jié)果如下： 表 5 檢測線不同包被量對應(yīng)的檢測結(jié)果 包被濃度 檢測樣本 3mg/ml 1ng/ml 177。 177。 177。 177。 － 2ng/ml 177。 177。 177。 177。 － ＋ ＋ ＋ ＋ 177。 3ng/ml ＋ ＋ ＋ ＋ 177。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，檢測線包被濃度過小時(shí)，弱陽性標(biāo)本容易出現(xiàn)漏檢；包被濃度過大，將使產(chǎn)品的靈敏度太高， 則容易出現(xiàn)假陽性條帶。 1) 1mg/ml 包被濃度過低，導(dǎo)致靈敏度不足，檢測 陰。而 3mg/ml、 、 2mg/ml ，檢測 1ng/ml 與 2ng/ml均出現(xiàn)假陽，結(jié)合成本考慮，選擇 ； 2) ，故建議提高膠體金工作液的稀釋倍數(shù)以降低靈敏度。 鼠 抗 HBsAg 單克隆抗體 B－ GOLD 工作液稀釋倍數(shù)確定 用 金標(biāo)結(jié)合物稀釋液 作為金標(biāo)抗 體 的保護(hù)液，將離心后的膠體金抗 體 結(jié)合物 100倍稀釋測定 A524nm，體積 V1，分別按照 100A524nm,V1/ 100A524nm,V1/3 100A524nm,V1/40 計(jì)算稀釋后的體積 V2。 將稀釋后的抗 體 工作液按照每 1 毫升涂布 100cm2無紡布， 37℃干燥 4 小時(shí)，與樣品墊、固相反應(yīng)膜等其它輔料依次粘貼，裁切寬度為 1cm 檢測內(nèi)質(zhì)控靈敏度參考品， 比較檢測試條的效果。 第 11 頁 共 23 頁 表 6 鼠抗 HBsAg抗體 GOLD工作液稀釋倍數(shù)確定 稀釋倍數(shù) 檢測樣本 1/30 1/35 1/40 1ng/ml － － 177。 2ng/ml － 177。 177。 177。 ＋ ＋ 3ng/ml 177。 ＋ ＋ 備注： 100A524nm,V1/ 100A524nm,V1/3 100A524nm,V1/40分別用 1/ 1/3 1/40代替。 1)結(jié)果表明隨著稀釋倍數(shù)的增加，檢測試條的靈敏度 降低 ；反之，靈敏度提高。 1/30計(jì)算金標(biāo)抗體工作液稀釋體積時(shí)，檢測 ，而1/40 檢測 1ng/ml 及 2ng/ml 標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)則出現(xiàn)假陽； 2)1/35 計(jì)算金標(biāo)抗體工作液稀釋體積時(shí)雖然檢測 2ng/ml 標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)仍出現(xiàn)假陽，但檢測 1ng/ml 及 、 3ng/ml 標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)均符合要求，故選擇 1/35 計(jì)算金標(biāo)抗體膠體金工作液稀釋體積。 3）建議減小裁切寬度以降 低靈敏度，消除假陽。 鼠抗 HBsAg 抗體 GOLD 反應(yīng)膜組裝 (裁切 )寬度 優(yōu)化 將預(yù)先吸附有鼠抗 HBsAg 抗體 GOLD 結(jié)合物的無紡布膜干燥后，裁成不同的寬度，與固相載體硝酸纖維反應(yīng)膜以及其它輔料依次粘貼后，裁切成試紙條，測試內(nèi)質(zhì)控靈敏度參考品，結(jié)果如下， 表 7 鼠抗 HBsAg抗體 GOLD反應(yīng)膜組裝 (裁切 )寬度選擇 S4寬度 (mm) 檢測濃度 5 6 7 8 9 1ng/ml － － － － － － － － － 2ng/ml － － － － － － － － 177。 177。 177。 177。 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 3ng/ml 177。 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 從上述結(jié)果可以看出，當(dāng)寬度為 5mm，檢測 ，寬度小于 6mm 時(shí)，檢測 ；寬度為 9mm 時(shí)，檢測 2ng/ml 樣本與時(shí)出現(xiàn)假陽，而 、 、 裁切寬度檢測陰性及陽性標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)均符合要求，故選擇金標(biāo)抗體無紡布裁切寬度為 177。 1mm。 對照線 包被濃度的確定 第 12 頁 共 23 頁 確定包被體積后 ()，將稀釋成不同 羊抗鼠 IgG 抗體 濃度： 2mg/ml、 1mg/ml、 ， 進(jìn)行硝酸纖維素膜噴涂，重復(fù)做三批。用制備好的樣品墊、免疫金結(jié)合墊以及其它輔料依次粘貼制成試劑條， 通過檢測 1 份內(nèi)質(zhì)控強(qiáng)陽性參考品、 1 份內(nèi)質(zhì)控陰性參考品， 在 30 分鐘內(nèi)判定結(jié)果， 比較 對照線的顯色情況，結(jié)果如下表， 表 8 對照線顯色情況 濃度及 S1批次 檢測樣本 2mg/ml lot1 lot2 lot3 lot1 lot2 lot3 lot1 lot2 lot3 lot1 lot2 lot3 P1 +++ +++ +++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ + + + N3 +++ +++ +++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ + + + 試驗(yàn)結(jié)果表明，對照線抗體的濃度小于 1mg/ml 時(shí)，對照線顯色不是很明顯，當(dāng)達(dá)到 1mg/ml 以上時(shí)，顯色情況就比較好，由于濃度選得太高，不僅增加成本，而且存在擴(kuò)散的可能性，造成一定的假陽性。因此，選擇 1mg/ml 為對照線的包被濃度。 鼠抗 HBsAg 抗體 GOLD 結(jié)合物反應(yīng)膜 干燥條件選擇 將 鼠抗 HBsAg 抗體 GOLD 結(jié)合物工作液稀釋后， 以每毫升 100cm2的面積均勻涂布在無紡布上，進(jìn)行干燥條件的比較試驗(yàn)。根據(jù)以往經(jīng)驗(yàn)，膠體金標(biāo)記蛋白在 20℃ 冷凍干燥并不穩(wěn)定，因此我們選擇了 37℃ 、室溫 兩 種條件進(jìn)行干燥試驗(yàn)， 測試內(nèi)質(zhì)控靈敏度參考品， 30分鐘判斷結(jié)果。 表 9 鼠抗 HBsAg抗體 GOLD結(jié)合物反應(yīng)膜干燥比較 條件及時(shí)間 檢測樣本 37℃ 室溫 2（ h） 4（ h） 6（ h） 5（ h） 10（ h） 15（ h） 1ng/ml － － － － － － 2ng/ml 177。 － － 177。 － － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 3ng/ml ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 通過上述的試驗(yàn)結(jié)果，室溫、 37℃ 干燥過程中，涂布 抗 HBsGOLD 結(jié)合物稀釋液的無紡布反應(yīng)膜的顏色從紅色變?yōu)槁杂邪l(fā)藍(lán)。 我們通過對 室溫、 37℃的產(chǎn)生的結(jié)果對比，即當(dāng) 室溫 5 小時(shí)時(shí)， 37℃干燥 2h 時(shí)，無紡布干燥不徹底，膠體金 抗體爬升速度較慢，增加了結(jié)果判定時(shí)間，同時(shí)會(huì)出現(xiàn)假 第 13 頁 共 23 頁 陽性。 室溫 超過 10小時(shí)、 37℃超過 4小時(shí)時(shí)，檢測結(jié)果符合要求，結(jié)果判斷直觀。 在這里我們通過控制室溫和相對濕度，選擇室溫過夜晾干 (溫度為 18～ 26℃ ，相對濕度小于45%) 包被硝酸纖維素膜的干燥選擇 設(shè)定不同的干燥條件：室溫 (6小時(shí)、 12小時(shí)、 16小時(shí)、 18 小時(shí) )、 37℃干燥不同時(shí)間 (4 小時(shí)、 8小時(shí)、 12小時(shí)、 16小時(shí) )，濕度均低于 45%。封閉后再次經(jīng) 37℃干燥 4小時(shí)后，與制備好的樣品墊、免疫金結(jié)合墊以及其它輔料依次粘貼制成試劑條，檢測內(nèi)質(zhì)控參考品，在 30 分鐘內(nèi)判定結(jié)果。 表 10 包被膜干燥選擇 條件及時(shí)間 檢測樣本 室溫 37℃ 干燥 6（ h） 12（ h） 16（ h） 18（ h） 4（ h） 8（ h） 12（ h） 16（ h） 1ng/ml － － － － － － － － 2ng/ml 177。 － － － 177。 － － － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 3ng/ml ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 從上述結(jié)果可以看出，當(dāng)濕度低于 45%時(shí)，室溫 6小時(shí)、 37℃ 干燥 4小時(shí) 時(shí)，測試2ng/ml 參考品時(shí)，因?yàn)橄跛崂w維素膜沒有徹底干燥，樣品的爬升速度較慢，而且膜面褪白不是很好； 室溫 12 時(shí)、 37℃ 干燥 8小時(shí) 時(shí)，檢測結(jié)果均符合標(biāo)準(zhǔn)要求，樣本爬升的速度正常，膜面干凈，結(jié)構(gòu)直觀、容易判斷；室溫 18 小時(shí)、 37℃ 干燥 16 小時(shí) 的檢測結(jié)果一致，色度 沒有明顯的差別。 因此，包被硝酸纖維素膜可以選擇室溫或 37℃過夜干燥。 封閉時(shí)間的選擇 設(shè)定不同的封閉條件：室溫 (1小時(shí)、 2小時(shí)、 4 時(shí)、 6小時(shí) )、 37℃ (1小時(shí)、 2小時(shí)、4 小時(shí)、 6 時(shí) )，封閉后再次經(jīng) 37℃干燥 4 小時(shí)后，與制備好的樣品墊、免疫金結(jié)合墊以及其它輔料依次粘貼