【正文】 第 21 頁 附圖 1 乙型肝炎病毒表面抗原檢測試劑盒 （膠體金法）生產(chǎn)工藝流程圖 第23 頁 第 2 頁 共 23 頁 A、研究擇要 本檢測試紙 是由固相有純化的高特異性鼠抗 HBsAg單克隆抗體 A(檢測線 )和羊抗鼠IgG 多克隆抗體 (對照線 )的硝酸纖維素膜、吸附有膠體金標(biāo)記抗 HBsAg 單克隆抗體 B 的無紡布膜、玻璃纖維、吸水紙等其它輔料因此粘貼制成，用于定性的檢測人血清 /血漿中乙型肝炎病毒表面抗原。 1 金標(biāo)反應(yīng)膜制備 表 2 金標(biāo)反應(yīng)膜清單 物料編碼 輔料名稱 規(guī)格 批配料量（ 1000板） F0023 無紡布 38cm27cm 30張 Y002/ HBsAg 鼠抗 HBsAg單克隆抗體 B / 120mg 注： (1)Y002/ HBsAg的包裝規(guī)格可以不同，但是總量一定。 經(jīng) 3 次 30 分鐘的離心，離心速度為： 5000rpm、 7000rpm、 9000rpm，合并 三 次收集的沉淀 (體積 V1)。 (3)包被后的硝酸纖維素膜過夜晾干。 3) 血清 樣 本應(yīng)收集在不含任何抗凝劑的試管中，血漿 樣 本應(yīng)收集于含有正常使用量檸檬酸鈉、肝素、 EDTA 等抗凝劑的容器中。 3) 等待紅線出現(xiàn)，應(yīng)在 1020分鐘時(shí)觀察反應(yīng)結(jié)果， 30 分鐘結(jié)果判定無效。結(jié)果表明 ，線條精細(xì)。l、 4181。l 加入孔中，重復(fù)三次； 4) 每孔分別加入 2181。l 14181。l、 、 5181。 表 4 涂布預(yù)檢結(jié)果 內(nèi)質(zhì)控參考品 P1 P2 N2 N4 檢測結(jié)果 + + 內(nèi)質(zhì)控參考品 1ng/ml 2n/ml 檢測結(jié)果 177。 177。 3ng/ml ＋ ＋ ＋ ＋ 177。 177。 177。因此，選擇 1mg/ml 為對照線的包被濃度。 在這里我們通過控制室溫和相對濕度，選擇室溫過夜晾干 (溫度為 18～ 26℃ ，相對濕度小于45%) 包被硝酸纖維素膜的干燥選擇 設(shè)定不同的干燥條件：室溫 (6小時(shí)、 12小時(shí)、 16小時(shí)、 18 小時(shí) )、 37℃干燥不同時(shí)間 (4 小時(shí)、 8小時(shí)、 12小時(shí)、 16小時(shí) )，濕度均低于 45%。 － － － 177。 結(jié)論 金標(biāo)反應(yīng)膜制備 表 13 金標(biāo)反應(yīng)膜清單 物料 編碼 輔料名稱 規(guī)格 批配料量（ 1000板） F0023 無紡布 38cm27cm 30張 Y002/ HBsAg 抗 HBs單克隆 抗體 B / 120mg 注： (1)Y002/ HBsAg的包裝規(guī)格可以不同，但是總量一定。 經(jīng) 3 次 30 分鐘的離心，離心速度為： 5000rpm、 7000rpm、 9000rpm，合并 三 次收集的沉淀 (體積 V1)。 (3)包被后的硝酸纖維素膜過夜晾干。 如不及時(shí)測定可在 28℃ 冷藏 3 天 。嚴(yán)重溶血和乳糜樣本不能用于檢測，以免引起誤判；已經(jīng)進(jìn)行加熱處理的樣本及已被微生物污染的樣本不能用于檢測 。在這里主要討論插入的深度 ， 以樣本在試條上的移行速度、背景的干凈純度和是否能觀察反應(yīng)為依據(jù)進(jìn)行以下不同反應(yīng)時(shí)間的比較試驗(yàn)。主要考察測試條靈敏度和特異性，其次考察條帶的集中和清晰程度以及樣品的移行速度。 六 ．體系的有效性 確定方法 (校準(zhǔn)、質(zhì)控方法 ) 內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn) 本公司生產(chǎn)的 乙型肝炎病毒表面抗原檢測試劑盒 (膠體金法 )有一個內(nèi)在的質(zhì)控指標(biāo)，即對照線作為內(nèi)在的過程控制。 對于怎樣取得對照樣本等，可以和生產(chǎn)商進(jìn)行聯(lián)系，也可以按照測試實(shí)驗(yàn)室建立的標(biāo)準(zhǔn)、國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)等建立。 如果對照線區(qū)域不能出現(xiàn)有色條帶，將測試無效，應(yīng)當(dāng)重新進(jìn)行測試。主要考察測試條的移行速度，其次考察條帶的集中和清晰程度。 五．體系的反應(yīng)條件 反應(yīng)時(shí)間 為確定反應(yīng)結(jié)果的最佳觀察時(shí)間， 需要考慮膜條褪白情況， 用 最低檢出限參考品進(jìn)行檢測確認(rèn)，結(jié)果如下 表 20 最低檢測線樣本觀察結(jié)果 反應(yīng)時(shí)間 (min) 檢測樣本 2 5 7 10 15 20 30 60 1ng/ml / / / － － － － － － － － ＋ － 4ng/ml / / / － ＋ ＋ ＋ ＋ 從上述結(jié)果可以看出，當(dāng)時(shí)間小于 10 分鐘時(shí)，不能正確觀察結(jié)果；大于 10 分鐘時(shí)，膜面完全褪白， 15 分鐘時(shí)， 3ng/ml 顯陽性， 30 分鐘時(shí) ， 60分鐘時(shí)，由于膜面變干等原因， 。如果收集的當(dāng)天不使用，應(yīng)當(dāng)冷藏 28℃ 保存，超過 7天應(yīng)當(dāng)冷凍于 20 ℃ 保存。即在測試濃度水平，輕度、重度溶血、黃疸及脂血的樣品對本試劑盒的檢測結(jié)果基本沒有干擾。鋁箔袋密封，室溫存放。鋁箔袋密封，室溫存放。共制備 2 瓶。封閉后再次經(jīng) 37℃干燥 4小時(shí)后，與制備好的樣品墊、免疫金結(jié)合墊等制成試劑條，檢測內(nèi)質(zhì)控靈敏度參考品，在 30 分鐘內(nèi)判定結(jié)果。 － － － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 3ng/ml ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 從上述結(jié)果可以看出，當(dāng)濕度低于 45%時(shí)，室溫 6小時(shí)、 37℃ 干燥 4小時(shí) 時(shí)，測試2ng/ml 參考品時(shí)，因?yàn)橄跛崂w維素膜沒有徹底干燥，樣品的爬升速度較慢，而且膜面褪白不是很好； 室溫 12 時(shí)、 37℃ 干燥 8小時(shí) 時(shí)，檢測結(jié)果均符合標(biāo)準(zhǔn)要求，樣本爬升的速度正常，膜面干凈，結(jié)構(gòu)直觀、容易判斷；室溫 18 小時(shí)、 37℃ 干燥 16 小時(shí) 的檢測結(jié)果一致，色度 沒有明顯的差別。 － － 177。 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 從上述結(jié)果可以看出，當(dāng)寬度為 5mm，檢測 ，寬度小于 6mm 時(shí)，檢測 ；寬度為 9mm 時(shí)，檢測 2ng/ml 樣本與時(shí)出現(xiàn)假陽，而 、 、 裁切寬度檢測陰性及陽性標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)均符合要求，故選擇金標(biāo)抗體無紡布裁切寬度為 177。 1)結(jié)果表明隨著稀釋倍數(shù)的增加，檢測試條的靈敏度 降低 ；反之，靈敏度提高。 鼠 抗 HBsAg 單克隆抗體 B－ GOLD 工作液稀釋倍數(shù)確定 用 金標(biāo)結(jié)合物稀釋液 作為金標(biāo)抗 體 的保護(hù)液，將離心后的膠體金抗 體 結(jié)合物 100倍稀釋測定 A524nm，體積 V1，分別按照 100A524nm,V1/ 100A524nm,V1/3 100A524nm,V1/40 計(jì)算稀釋后的體積 V2。 177。 2)檢測 ，出現(xiàn)假陰。g/ml 為鼠抗 HBs單克隆抗體 B與 2:2 膠體金結(jié)合的最小蛋白標(biāo) 記濃度； 第 9 頁 共 23 頁 抗 HBs— GOLD 的制備 膠體金溶液的選擇 3800ml純化水加熱至沸騰后快速加入 80 毫升膠體金氧化劑，同時(shí)分別加入膠體金還原劑 80 毫升，繼續(xù)煮沸，觀察溶液顏色由黃色變黑再變紫，最后變成穩(wěn)定的酒紅色后，計(jì)時(shí)繼續(xù)煮沸 10分鐘，室溫下冷卻，用純化水恢復(fù)至 4000ml； 膠體金結(jié)合物制備 1)分別取 100 毫升 2:2 膠體金溶液，按照 %的比例加入 pH 調(diào)節(jié)劑 800181。l，加 9 孔； 2) 各孔依次加入鼠抗 HBs單克隆抗體 B（濃度為 ） 1181。l 6181。l、 12181。 膠體金 — 抗體結(jié)合條件選擇 膠體金溶液的制備 該產(chǎn)品使用的膠體金是檸檬酸三鈉還原法制備的，具體方法如下： 1) 加熱一份 100毫升純化水，煮沸后快速加入 膠體金氧化劑； 2) 再加入 ml 的膠體金還原劑，繼續(xù)煮沸， 觀察溶液顏色由黃色變黑再變紫，最后變成穩(wěn)定的酒紅色后， 繼續(xù)煮沸 10min，停止加熱 ,室溫冷卻。 一、 主要生產(chǎn)工藝描述 (固相載體、顯色系統(tǒng)、指示系統(tǒng)等 ) 及確定依據(jù)； 1主要材料 (1) 主要原料 鼠抗 HBsAg 單克隆抗體 A(包被檢測線 ) 鼠抗 HBsAg 單克隆抗體 B(膠體金標(biāo)記 ) (2) 輔料 硝酸纖維素膜、吸水紙、玻璃纖維、無紡布、箭 頭膠、雙面膠帶、塑料基板、 (3) 化學(xué)試劑 Tris、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、 BSA、 EDTA、 Tween抗體稀釋液；氯金酸、檸檬酸三鈉、 PH調(diào)節(jié)劑、膠體金標(biāo)記物穩(wěn)定液 (4)測試樣本 包括本公司自己制定的內(nèi)質(zhì)控參考品、中國藥品生物制品檢定所提供的 HBsAg 酶標(biāo)類國家標(biāo)準(zhǔn)品。應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融，使用前不得超過 23 次。鋁箔袋密封，室溫存放。鋁箔袋密封，室溫存放。共制備 2 瓶。 對照線區(qū) 內(nèi)所顯現(xiàn)的有色條帶是判定是否有足夠標(biāo)本 ， 層析過程是否正常的標(biāo)準(zhǔn) ， 同時(shí)也作為試劑的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn) 。 若無 對照線 出現(xiàn)，則實(shí)驗(yàn)無效。 備注：每 1000 板需要該比例膠