【正文】 另外，如果試劑的有效、裝置工作正常，結(jié)果觀察窗口的背景將變白，同時提供一個直觀的結(jié)果。 第 20 頁 共 23 頁 表 19 樣品吸附時間的確定 時間 移行速度 30min反應(yīng)結(jié)果 2秒 很慢 有紅色，不清晰、集中，不能觀察反應(yīng) 5秒 慢 略有紅色，不清晰、集 中，基本能觀察反應(yīng) 8秒 較慢 背景干凈，色帶清晰，略有不集中，基本能觀察反應(yīng) 11秒 快 背景干凈，色帶清晰、集中，能正常觀察反應(yīng) 14秒 快 背景干凈，色帶清晰、集中，能正常觀察反應(yīng) 試驗結(jié)果表明，待檢樣品吸附時間過短，樣品在測試條上的遷移速度慢，不能在規(guī)定時間內(nèi)觀察反應(yīng)結(jié)果，且影響檢測的靈敏度，容易造成弱陽性樣本的漏檢；待檢樣品加樣量過多，試劑條顯色條帶易擴散，且容易出現(xiàn)假陽性條帶。 溶血、黃疸及 血脂 的樣品對本試劑的檢測結(jié)果的干擾 分別取 4 份內(nèi)質(zhì)控參考品 （每份包括 N P4及不同濃度的最低檢出限參考品） ，其中的 1 份為對照，另外 3 份中依 次加入血紅素 、甘油三酯 、血紅蛋白 4mg/ml，使用本公司生產(chǎn)的 乙型肝炎病毒表面抗原檢測試劑盒 (膠體金法 )進行檢測。 分切 將晾干的金標反應(yīng)膜按照 中間體配對確定的寬度 進行分切 (通常 177。 因此，封閉時間可以選擇室溫不低于 2小時－ 4小時。根據(jù)以往經(jīng)驗，膠體金標記蛋白在 20℃ 冷凍干燥并不穩(wěn)定，因此我們選擇了 37℃ 、室溫 兩 種條件進行干燥試驗， 測試內(nèi)質(zhì)控靈敏度參考品， 30分鐘判斷結(jié)果。 ＋ ＋ 3ng/ml 177。 177。l濃度 為 10%NaCl 溶液，混合，室溫下放置 5分鐘； 結(jié)果見表 3： 表 3 最小蛋白濃度實驗結(jié)果 (濃度：（ 181。l濃度為 10%NaCl 溶液，混合，室溫下靜置 5min； 6) 觀察膠體金顏色變化，記錄保持紅色的最低 pH 調(diào)節(jié)劑體積； 7) 膠體金顏色變化直到室溫下放置 2小時，記錄仍保持紅色的最低 pH 調(diào)節(jié)劑的體積； 結(jié)果見表 2： 表 2 最佳 pH實驗結(jié)果 編號 1 2 3 4 5 6 7 8 pH調(diào)節(jié)劑 2181。室溫 干燥過夜， 37℃封閉 4h。 4) 樣本收集后應(yīng)盡快檢測，不能將 樣 本在室溫放置太長的時間。 分切 將晾干的金標反應(yīng)膜按照 中間體配對確定的寬度 進行分切 (通常 177。 當進行檢測時 ， 若 為陽性標本 ， 樣本中的 HBsAg 與金標記的 抗 HBsAg 抗體 B 結(jié)合形成復(fù)合物 ，此復(fù)合物由于層析作用沿試紙條向前 移動 ，則 與 檢測線區(qū) 固相 的抗 HBs 抗體A形成“固相抗 HBsAg 抗體 A HBsAg金標記抗 HBsAg 抗體 B” 雙 抗體 夾心復(fù)合物 而凝聚 顯色 ； 若為陰性標本 ，在 檢測線 區(qū)域不能形成 雙 抗體 夾心復(fù)合物 ， 因此不顯色。g/ml的比例加入 Y002/ HBsAg (即每 1000ml 需要 Y002/ HBsAg 的重量為 15mg)，混勻，靜置 5 分鐘，然后加入 A103 溶液 16ml，混勻，靜置 5分鐘。嚴重溶血和乳糜樣本不能用于檢測，以免引起誤判；已經(jīng)進行加熱處理的樣本及已被微生物污染的樣本不能用于檢測 。 3操作 固相硝酸纖維素膜 對照線噴液量的選擇 將純化好的 羊抗鼠 IgG 多克隆 抗體稀釋到濃度為 1mg/ml， 用自動噴膜機噴涂質(zhì)控線，噴膜量分別為 、 、 ，比較用不同噴膜量所得的劃線效果。l； 第 8 頁 共 23 頁 3) 取一 48孔酶標板，按照 pH調(diào)節(jié)劑的加入量從低到高分別將上述膠體金取 100181。l、 、 4181。 用制備好的樣品墊、免疫金結(jié)合墊以及其它輔料依次粘貼制成試劑條，測試內(nèi)質(zhì)控靈敏度參考品，在 30分鐘內(nèi)判定結(jié)果，檢測結(jié)果如下： 表 5 檢測線不同包被量對應(yīng)的檢測結(jié)果 包被濃度 檢測樣本 3mg/ml 1ng/ml 177。 2ng/ml － 177。用制備好的樣品墊、免疫金結(jié)合墊以及其它輔料依次粘貼制成試劑條， 通過檢測 1 份內(nèi)質(zhì)控強陽性參考品、 1 份內(nèi)質(zhì)控陰性參考品， 在 30 分鐘內(nèi)判定結(jié)果， 比較 對照線的顯色情況，結(jié)果如下表， 表 8 對照線顯色情況 濃度及 S1批次 檢測樣本 2mg/ml lot1 lot2 lot3 lot1 lot2 lot3 lot1 lot2 lot3 lot1 lot2 lot3 P1 +++ +++ +++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ + + + N3 +++ +++ +++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ + + + 試驗結(jié)果表明，對照線抗體的濃度小于 1mg/ml 時，對照線顯色不是很明顯，當達到 1mg/ml 以上時，顯色情況就比較好，由于濃度選得太高，不僅增加成本，而且存在擴散的可能性，造成一定的假陽性。 第 14 頁 共 23 頁 表 11 封閉時間選擇 條件及時間 檢測樣本 室溫 37℃ 1（ h） 2（ h） 4（ h） 6（ h） 1（ h） 2（ h） 4（ h） 6（ h） 1ng/ml － － － － － － － － 2ng/ml 177。g/ml的比例加入 Y002/ HBsAg (即每 1000ml 需要 Y002/ HBsAg 的重量為 15mg)，混勻，靜置 5 分鐘，然后加入 A103 溶液 16ml，混勻，靜置 5分鐘。 結(jié)構(gòu)示意圖如下： 包 被 膜 1 2 3 5 1 樣品墊 2 – 金標反應(yīng)膜 3 – 硝酸纖維反應(yīng)膜 4 吸收墊 5 塑料板 4 質(zhì)控線 C 檢測線 T 加樣 液體層析方向 樣品 墊 膠體金膜 檢測線 T 質(zhì)控線 C 吸收墊 第 18 頁 共 23 頁 三．被測樣本的要求 樣 本收集 后應(yīng) 盡快分離血清或血漿以避 免 溶 血 ， 檢測時應(yīng)盡量使用新鮮的 樣 本 。 四．試劑用量 樣本量 因為本試條的加樣方法為直接將有箭頭標志線一端插入裝有血清 樣 本的容器，要求深 度不可超過標志線，所以插入的深度與插入后的吸附時間均對吸附的樣本量有關(guān)系。因此，我們選擇最佳的試驗環(huán)境濕度為 30%－ 70%。應(yīng)當聯(lián)系供應(yīng)商進行咨詢。 第 21 頁 共 23 頁 表 21 反應(yīng)時間的 膜面褪白時間 確定試驗 反應(yīng)時間 反應(yīng)結(jié)果 1 min 樣品將測試條觀察部分整個浸濕，質(zhì)控線隱約可見，背景為微紅色 2 min 質(zhì)控線已經(jīng)比較清楚，檢測線隱約可見，背景為微紅色 5min 質(zhì)控線、檢測線均已經(jīng)比較清楚，微紅色背景逐漸褪去 10 min 質(zhì)控線、檢測線均已經(jīng)比較清楚，觀察部分背景基本 干凈 15min 質(zhì)控線、檢測線清晰、集中，觀察部分背景基本干凈 20min 質(zhì)控線、檢測線清晰、集中，觀察部分背景干凈 30 min 質(zhì)控線、檢測線清晰、集中，觀察部分背景干凈 60 min 質(zhì)控線、檢測線顏色變深，條帶略有擴散，觀察部分背景干凈 上述試驗結(jié)果，對待檢樣品反應(yīng)結(jié)果的觀察以質(zhì)控線、檢測線的清晰與集中程度，以及背景的干凈程度判斷，最佳目測判斷結(jié)果的時間應(yīng)在 10－ 30 分鐘讀取， 30 分鐘后條帶顏色和集中程度開始變化。但仍推薦使用清澈、無溶血及黃疸的血清或血漿樣品進行檢測。 硝酸纖維反應(yīng)膜制備 第 16 頁 共 23 頁 表 14 硝酸纖維反應(yīng)膜清單 物料編碼 輔料名稱 規(guī)格 批配料量（ 1000板） F0013 硝酸纖維膜 27cm16cm 125張 HBSAG01 HBsAg 01包被液 HBSAG03 HBsAg 03包被液 注： (1) 每 ml包被液可以包被 25 板；每 1000板需要 40ml包被液； (2) 每張硝酸纖維膜計為 8板； (3) 硝酸纖維反應(yīng)膜沿膜上密虛線標志線分切。 表 12 包被膜干燥選擇 干燥條件 檢測濃度 室溫 37℃ 干燥 6 12 16 18 4 8 12 16 1ng/ml － － － － － － － － 2ng/ml 177。 － － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 3ng/ml ＋ ＋ ＋ ＋ ＋