【文章內容簡介】 天津基準化學試劑有限公司 NαCBZGlnGly分析純sigma公司L谷氨酸γ單羥肟酸分析純sigma公司鹽酸分析純北京北化精細化學品有限責任公司考馬斯亮藍G250分析純天津市光復精細化工研究所考馬斯亮藍R250分析純天津市光復精細化工研究所聚乙二醇分析純天津基準化學試劑有限公司瓊脂糖生化試劑上海藍季科技發(fā)展有限公司TEMED生化試劑Solarbio公司低分子量標準蛋白生化試劑Solarbio公司溴酚藍生化試劑Solarbio公司β巰基乙醇生化試劑Solarbio公司SDS生化試劑SCIENTIFIC RESEARCH SPECIA LTrisbase生化試劑SCIENTIFIC RESEARCH SPECIAL 實驗方法 轉谷氨酰胺酶酶活的測定 轉谷氨酰胺酶酶酶活力的測定原理轉谷氨酰胺酶不僅能催化蛋白的谷氨酰胺殘基水解或導入伯胺，從而釋放出NH3而且也可催化一些含谷氨酰胺?；亩嚯漠a生此類反應。Folk等就是利用這個特性，設計了一種轉谷氨酸胺方法[16,17]，其具體催化反應如下： TGase CHCH2OHN a CBZGInGly+H2NCHCH2OH Na CBZGInGly +NH3上式產生的Hydroxamic acid鹽可與三價鐵離子形成很穩(wěn)定的絡合物，呈紫紅色，而且色澤與該絡合物量呈正相關，于是通過定量該化合物可測量轉谷氨酰胺酶的活力。標準曲線采用L谷氨酸γ單羥肟酸制作。 L谷氨酸γ單羥肟酸標準曲線的繪制，溶于30mL蒸餾水中配制成10mmol/L的溶液，取八支具塞試管，一支作為空白對照，在空白管中加入1mL蒸餾水，，，，，，，，然后于八支試管中分別加入已經預熱到37℃的2mLA試劑，于37℃水浴反應10min，立即取出加入已經預熱到37℃的2mLB試劑終止反應，于525nm下測定其吸光值，平行測定3次，取其平均值，以濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，作圖，得到標準曲線。 酶活力的測定方法先配制所需要的試劑A和試劑B。試劑A：（pH=），；試劑B：3mol/LHCl，12%三氯乙酸及5％FeCl36H2O（）等體積混合。將已經分別預熱到37℃的試劑A與酶液在37℃反應10min后，添加預熱到37℃的試劑B終止酶反應，并形成紅色鐵化合物，在4000r/min的轉速下離心15min除去沉淀，上清液于525nm測定吸光度。計算酶活方法采用經驗公式如下：酶活（U/mL）= （公式21）A：吸光值：酶的稀釋倍數(shù)10：反應10分鐘：參加反應體積1單位轉谷氨酰胺酶酶活力單位定義為：37℃每分鐘產生1μmolL谷氨酸γ單羥肟酸所需酶量（U/mL）。相對酶活：以相同條件下所測定的最高酶活力定義為100，其余與之相比所得的數(shù)為相對酶活。 轉谷氨酰胺酶蛋白含量的測定根據(jù)蛋白質的理化性質，現(xiàn)已提出多種蛋白質定量方法。考馬斯亮藍G－250法是比色法與色素法相結合的復合方法，簡便快捷，靈敏度高，穩(wěn)定性好，是一種較好的常用方法。在此就運用考馬斯亮藍法[13] 測定轉谷氨酰胺酶中的蛋白含量。 考馬斯亮藍法測蛋白含量標準曲線的繪制取6支具塞試管，編號后，按21表加入試劑。蓋上塞子，搖勻。放置2min后在595 nm波長下比色測定（比色應在 l h內完成）。以牛血清白蛋白含量（μg）為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪出標準曲線。表21 繪制考馬斯亮藍標準曲線配方表操作項目管 號1 2 3 4 5 6標準蛋白質溶液/mL0 0. 6 蒸餾水/mL 0G250試劑/mL各5蛋白質含量/μg0 20 40 60 80 100注：G250考馬斯亮藍溶液：稱取100mg G250考馬斯亮藍，加入95%乙醇50mL，再加800mL水，加100mL 85%磷酸，定容至1000mL。 測蛋白含量的方法樣品中蛋白質含量的測定取1支具塞試管， mL樣品提取液， mL蒸餾水，5mL考馬斯亮藍G－250試劑，充分混合，放置2min后，以標準曲線1號試管做參比，在595 nm波長下比色，記錄吸光度，并繪制標準曲線。根據(jù)所測樣品提取液的吸光度，在標準曲線上查得相應的蛋白質含量（μg），按下式計算： 樣品蛋白質含量（μg／g鮮重）＝（查得的蛋白質含量（μg）提取液總體積（mL））／（樣品鮮重（g）測定時取用提取液的體積（mL）） 轉谷氨酰胺酶分離純化 轉谷氨酰胺酶酶液的制備，定容至1L后。取粗酶粉1g，溶于100mL 4℃冰浴的30 mmol/L 醋酸緩沖液()，待完全溶解后備用。 轉谷氨酰胺酶的硫酸銨分級沉淀取上述粗酶液，在粗酶液中加入固體硫酸銨至飽和度為35%（見表22），在冰箱中過夜，離心(8000r/min、10min)后，取上清液加入固體硫酸銨至飽和度為45%，冰箱中過夜，離心(8000r/min、10min)，在上清液加入固體硫酸銨至飽和度為55%，在冰箱過夜后，離心(8000r/min、10min)，直到將溶液的飽和度調到85%為止。表22 調整硫酸銨溶液飽和度計算表飽和度% 25 354555657585每100mL溶液加硫酸銨克數(shù) 分別測定以上6組上清液及沉淀中的酶活力，并以未加硫酸銨的粗酶液中的酶活力為100%，計算不同飽和度下上清液及沉淀中的酶相對活力，以硫酸銨的飽和度為橫坐標，酶相對活力為縱坐標繪制鹽析曲線。以上述測定結果選擇適宜的飽和度對粗酶液進行分級沉淀，酶蛋白沉淀物用TrisHCl緩沖溶液溶解沉淀。TrisHCl緩沖溶液的配制：先取10mL市售鹽酸，加入20mL的蒸餾水，配制成4mHCL溶液。()，將Tris溶于200mL水中，加入50mL的4mHCL溶液，定容到100mL容量瓶中。 轉谷氨酰胺酶的超濾脫鹽及濃縮　將酶液裝入超濾杯，用30KD超濾膜，、來確定相對酶活的最佳操作壓強。將超濾后的酶取出后裝入透析袋中，用線繩系好后再放入10%的聚乙二醇溶液中濃縮12h，待測酶活與蛋白質含量。 轉谷氨酰胺酶凝膠過濾柱層析　80cm的Sephadex G100層析柱，（）平衡。調節(jié)流速至1mL/min。將上一步收集到的酶液透析脫鹽濃縮后，取3mL 上樣，（）洗脫，用分部收集器進行分部收集，每管約3mL。測吸光度，并繪制洗脫曲線。葡聚糖凝膠過濾柱層下的步驟如下：(1)葡聚糖凝膠的預處理：取5克葡聚糖凝膠（Sephadex100）干粉，浸泡于50mL蒸餾水中充分溶脹（室溫，12h），然后反復傾斜除去表面的懸浮微粒。(2)裝柱：將層析柱垂直固定在鐵架臺上，注意上下不要顛倒；將層析柱下端的止水螺絲旋緊，向柱中加入約12cm高的緩沖液，把溶脹好的糊狀凝膠邊攪拌邊倒入柱中，最好一次連續(xù)裝完，若分次裝入，需用玻璃棒輕輕攪動柱床上層凝膠，以免出現(xiàn)界面。裝柱長度至少8cm。自然沉降20min，最后放入略小于層析柱內徑的圓形濾紙片，以防將來加樣時凝膠被沖起。以恒流泵控制流速為1mL/min，用磷酸緩沖液洗脫平衡10min。注意在任何時候不要使液面低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內的流動與最終生物大分子物質的分離效果。 （3）上樣及洗脫：將柱中多余的溶液放出，待液體降至膠面時，取透析、濃縮后的酶液5mL，小心加到凝膠柱上，打開管夾，使樣品溶液流入柱內，待樣品液面降至膠面時，加少許洗脫緩沖液將粘附在柱上的殘余樣品洗下，讓其進入膠內，重復兩次，打開恒流泵，以1mL/min的速度用洗脫緩沖液洗脫，自動部分收集器收集洗脫液1mL/管。將洗脫液隔2管測定其酶活力和蛋白含量，得到轉谷氨酰胺酶的洗脫曲線。 轉谷氨酰胺酶酶純度的分析及分子量的測定　對所純化的蒜氨酸酶通過SDSPAGE進行分析，依據(jù)標準蛋白分子量推斷轉谷氨酰胺酶的分子量。采用不連續(xù)電泳，12%分離膠，4%濃縮膠。以10mA電流電泳4小時，用考馬斯亮蘭液染色3h，脫色。將底色脫凈的凝膠照相、觀察其分子量。濃縮膠貯備液配比為5%丙烯酰胺，%甲叉雙丙烯酰胺溶液；分離膠貯備液配比為10%丙烯酰胺，%甲叉雙丙烯酰胺溶液。，。%。樣品處理液配比為20%的10%SDS溶液，5%的β巰基乙醇，40%的蔗糖，20%溴酚藍，20%， TrisHCl緩沖液。具體步驟如