【文章內(nèi)容簡介】 天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司 NαCBZGlnGly分析純sigma公司L谷氨酸γ單羥肟酸分析純sigma公司鹽酸分析純北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司考馬斯亮藍(lán)G250分析純天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所考馬斯亮藍(lán)R250分析純天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所聚乙二醇分析純天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司瓊脂糖生化試劑上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司TEMED生化試劑Solarbio公司低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白生化試劑Solarbio公司溴酚藍(lán)生化試劑Solarbio公司β巰基乙醇生化試劑Solarbio公司SDS生化試劑SCIENTIFIC RESEARCH SPECIA LTrisbase生化試劑SCIENTIFIC RESEARCH SPECIAL 實(shí)驗(yàn)方法 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶活的測定 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶酶活力的測定原理轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶不僅能催化蛋白的谷氨酰胺殘基水解或?qū)氩?，從而釋放出NH3而且也可催化一些含谷氨酰胺?；亩嚯漠a(chǎn)生此類反應(yīng)。Folk等就是利用這個特性，設(shè)計了一種轉(zhuǎn)谷氨酸胺方法[16,17]，其具體催化反應(yīng)如下： TGase CHCH2OHN a CBZGInGly+H2NCHCH2OH Na CBZGInGly +NH3上式產(chǎn)生的Hydroxamic acid鹽可與三價鐵離子形成很穩(wěn)定的絡(luò)合物，呈紫紅色，而且色澤與該絡(luò)合物量呈正相關(guān)，于是通過定量該化合物可測量轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的活力。標(biāo)準(zhǔn)曲線采用L谷氨酸γ單羥肟酸制作。 L谷氨酸γ單羥肟酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，溶于30mL蒸餾水中配制成10mmol/L的溶液，取八支具塞試管，一支作為空白對照，在空白管中加入1mL蒸餾水，，，，，，，，然后于八支試管中分別加入已經(jīng)預(yù)熱到37℃的2mLA試劑，于37℃水浴反應(yīng)10min，立即取出加入已經(jīng)預(yù)熱到37℃的2mLB試劑終止反應(yīng)，于525nm下測定其吸光值，平行測定3次，取其平均值，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。 酶活力的測定方法先配制所需要的試劑A和試劑B。試劑A：（pH=），；試劑B：3mol/LHCl，12%三氯乙酸及5％FeCl36H2O（）等體積混合。將已經(jīng)分別預(yù)熱到37℃的試劑A與酶液在37℃反應(yīng)10min后，添加預(yù)熱到37℃的試劑B終止酶反應(yīng)，并形成紅色鐵化合物，在4000r/min的轉(zhuǎn)速下離心15min除去沉淀，上清液于525nm測定吸光度。計算酶活方法采用經(jīng)驗(yàn)公式如下：酶活（U/mL）= （公式21）A：吸光值：酶的稀釋倍數(shù)10：反應(yīng)10分鐘：參加反應(yīng)體積1單位轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶活力單位定義為：37℃每分鐘產(chǎn)生1μmolL谷氨酸γ單羥肟酸所需酶量（U/mL）。相對酶活：以相同條件下所測定的最高酶活力定義為100，其余與之相比所得的數(shù)為相對酶活。 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶蛋白含量的測定根據(jù)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，現(xiàn)已提出多種蛋白質(zhì)定量方法?？捡R斯亮藍(lán)G－250法是比色法與色素法相結(jié)合的復(fù)合方法，簡便快捷，靈敏度高，穩(wěn)定性好，是一種較好的常用方法。在此就運(yùn)用考馬斯亮藍(lán)法[13] 測定轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶中的蛋白含量。 考馬斯亮藍(lán)法測蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取6支具塞試管，編號后，按21表加入試劑。蓋上塞子，搖勻。放置2min后在595 nm波長下比色測定（比色應(yīng)在 l h內(nèi)完成）。以牛血清白蛋白含量（μg）為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。表21 繪制考馬斯亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線配方表操作項(xiàng)目管 號1 2 3 4 5 6標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液/mL0 0. 6 蒸餾水/mL 0G250試劑/mL各5蛋白質(zhì)含量/μg0 20 40 60 80 100注：G250考馬斯亮藍(lán)溶液：稱取100mg G250考馬斯亮藍(lán)，加入95%乙醇50mL，再加800mL水，加100mL 85%磷酸，定容至1000mL。 測蛋白含量的方法樣品中蛋白質(zhì)含量的測定取1支具塞試管， mL樣品提取液， mL蒸餾水，5mL考馬斯亮藍(lán)G－250試劑，充分混合，放置2min后，以標(biāo)準(zhǔn)曲線1號試管做參比，在595 nm波長下比色，記錄吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)所測樣品提取液的吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的蛋白質(zhì)含量（μg），按下式計算： 樣品蛋白質(zhì)含量（μg／g鮮重）＝（查得的蛋白質(zhì)含量（μg）提取液總體積（mL））／（樣品鮮重（g）測定時取用提取液的體積（mL）） 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶分離純化 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶液的制備，定容至1L后。取粗酶粉1g，溶于100mL 4℃冰浴的30 mmol/L 醋酸緩沖液()，待完全溶解后備用。 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的硫酸銨分級沉淀取上述粗酶液，在粗酶液中加入固體硫酸銨至飽和度為35%（見表22），在冰箱中過夜，離心(8000r/min、10min)后，取上清液加入固體硫酸銨至飽和度為45%，冰箱中過夜，離心(8000r/min、10min)，在上清液加入固體硫酸銨至飽和度為55%，在冰箱過夜后，離心(8000r/min、10min)，直到將溶液的飽和度調(diào)到85%為止。表22 調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計算表飽和度% 25 354555657585每100mL溶液加硫酸銨克數(shù) 分別測定以上6組上清液及沉淀中的酶活力，并以未加硫酸銨的粗酶液中的酶活力為100%，計算不同飽和度下上清液及沉淀中的酶相對活力，以硫酸銨的飽和度為橫坐標(biāo)，酶相對活力為縱坐標(biāo)繪制鹽析曲線。以上述測定結(jié)果選擇適宜的飽和度對粗酶液進(jìn)行分級沉淀，酶蛋白沉淀物用TrisHCl緩沖溶液溶解沉淀。TrisHCl緩沖溶液的配制：先取10mL市售鹽酸，加入20mL的蒸餾水，配制成4mHCL溶液。()，將Tris溶于200mL水中，加入50mL的4mHCL溶液，定容到100mL容量瓶中。 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的超濾脫鹽及濃縮　將酶液裝入超濾杯，用30KD超濾膜，、來確定相對酶活的最佳操作壓強(qiáng)。將超濾后的酶取出后裝入透析袋中，用線繩系好后再放入10%的聚乙二醇溶液中濃縮12h，待測酶活與蛋白質(zhì)含量。 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶凝膠過濾柱層析　80cm的Sephadex G100層析柱，（）平衡。調(diào)節(jié)流速至1mL/min。將上一步收集到的酶液透析脫鹽濃縮后，取3mL 上樣，（）洗脫，用分部收集器進(jìn)行分部收集，每管約3mL。測吸光度，并繪制洗脫曲線。葡聚糖凝膠過濾柱層下的步驟如下：(1)葡聚糖凝膠的預(yù)處理：取5克葡聚糖凝膠（Sephadex100）干粉，浸泡于50mL蒸餾水中充分溶脹（室溫，12h），然后反復(fù)傾斜除去表面的懸浮微粒。(2)裝柱：將層析柱垂直固定在鐵架臺上，注意上下不要顛倒；將層析柱下端的止水螺絲旋緊，向柱中加入約12cm高的緩沖液，把溶脹好的糊狀凝膠邊攪拌邊倒入柱中，最好一次連續(xù)裝完，若分次裝入，需用玻璃棒輕輕攪動柱床上層凝膠，以免出現(xiàn)界面。裝柱長度至少8cm。自然沉降20min，最后放入略小于層析柱內(nèi)徑的圓形濾紙片，以防將來加樣時凝膠被沖起。以恒流泵控制流速為1mL/min，用磷酸緩沖液洗脫平衡10min。注意在任何時候不要使液面低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果。 （3）上樣及洗脫：將柱中多余的溶液放出，待液體降至膠面時，取透析、濃縮后的酶液5mL，小心加到凝膠柱上，打開管夾，使樣品溶液流入柱內(nèi)，待樣品液面降至膠面時，加少許洗脫緩沖液將粘附在柱上的殘余樣品洗下，讓其進(jìn)入膠內(nèi)，重復(fù)兩次，打開恒流泵，以1mL/min的速度用洗脫緩沖液洗脫，自動部分收集器收集洗脫液1mL/管。將洗脫液隔2管測定其酶活力和蛋白含量，得到轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的洗脫曲線。 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶純度的分析及分子量的測定　對所純化的蒜氨酸酶通過SDSPAGE進(jìn)行分析，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量推斷轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的分子量。采用不連續(xù)電泳，12%分離膠，4%濃縮膠。以10mA電流電泳4小時，用考馬斯亮蘭液染色3h，脫色。將底色脫凈的凝膠照相、觀察其分子量。濃縮膠貯備液配比為5%丙烯酰胺，%甲叉雙丙烯酰胺溶液；分離膠貯備液配比為10%丙烯酰胺，%甲叉雙丙烯酰胺溶液。，。%。樣品處理液配比為20%的10%SDS溶液，5%的β巰基乙醇，40%的蔗糖，20%溴酚藍(lán)，20%， TrisHCl緩沖液。具體步驟如