【文章內(nèi)容簡介】 ： 1074mm； 常州大學(xué)畢業(yè) 設(shè)計(jì)說明書 第 2 頁 共 27 頁 年平均濕度： 78%； 常年最大積雪深度： 22cm； 常年最大凍土深度： 12cm； 常年平均雷暴日數(shù)： 天； 全年無霜期： 250 天； 常年平均風(fēng)速： ； 常年最大風(fēng)速： （ 10 年平均）。 生產(chǎn)方法，流程特點(diǎn)，技術(shù)的先進(jìn)性和經(jīng)濟(jì)合理性 生產(chǎn)方法 采 用 黃色短桿菌 ATCC14067SGR突變株 進(jìn)行 液體發(fā)酵， 絮凝過濾 、電 滲析脫鹽 、 陰離子交換柱 、結(jié)晶 相耦合的方法 提取。 流程特點(diǎn) 發(fā)酵工段 流程特點(diǎn) 圖 1 發(fā)酵法生產(chǎn) L谷氨酰胺發(fā)酵工段工藝流程圖 [1] 以 黃色短桿菌 ATCC14067為親本菌株，利用 亞硝基胍（ NTG） 對其進(jìn)行誘變處理后，在不同濃度 磺胺胍 的基本培養(yǎng)平板上篩選得到 SG抗性突變株。并在此菌的基礎(chǔ)上，進(jìn)行低糖流加法培養(yǎng)及富集培養(yǎng)、 UV和 DES誘變處理選育得菌株。 將菌株置于斜面培養(yǎng)基培養(yǎng) 18 h，再 將菌種加入到一級種子罐中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng) 7 h的時(shí)間；緊接著將種子液接種到二級培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，接種量 7%，培養(yǎng) 3 h的時(shí)間；然后接種發(fā)酵罐中進(jìn)行深層液體發(fā)酵，接種量 10%，碳源轉(zhuǎn)化率 %，發(fā)酵 36 h時(shí)間， 最后可 得到 發(fā)酵液 t， 常州大學(xué)畢業(yè) 設(shè)計(jì)說明書 第 3 頁 共 27 頁 其中 LGln的量為 t。 提取工段 流程特點(diǎn) 圖 2 發(fā)酵法生產(chǎn) L谷氨酰胺 提取 工段工藝流程圖 [2] 電滲析脫鹽與單陰離子交換柱相耦合提取發(fā)酵液中谷氨酰胺的分離工藝，是將發(fā)酵液 pH調(diào)節(jié)到谷氨酰胺等電點(diǎn)附近 ， 通過電 滲析將其中的無機(jī)鹽脫除 95%左右時(shí)，仍然能保證谷氨酰胺收率達(dá)到 76%，電流效率為 85%。根據(jù)谷氨酰胺和谷氨酸等電點(diǎn)差異，電滲析脫鹽后的料液再通過單根陰離子樹脂交換柱，可以去除其中的谷氨酸等雜質(zhì)。與其他提取方法相比，該工藝大幅度地減少了樹脂用量，有效地解決了谷氨酰胺在強(qiáng)堿和強(qiáng)酸環(huán)境中的轉(zhuǎn)化問題，生產(chǎn)成本明顯降低。谷氨酰胺的總提取收率達(dá)到 70%左右，且產(chǎn)品純度符合藥典。 技術(shù)的先進(jìn)性和經(jīng)濟(jì)合理性 本設(shè)計(jì)采用微生物發(fā)酵法，菌種選用 黃色短桿菌 ATCC14067SGR突變株 ， 該菌株生 常州大學(xué)畢業(yè) 設(shè)計(jì)說明書 第 4 頁 共 27 頁 產(chǎn) LGln具有原材料 便宜 、 發(fā)酵周期合理 、 產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)。 單陰離子交換柱法是目前谷氨酰胺工業(yè)化生產(chǎn)的一種新型分離工藝，將其與電滲析脫鹽相耦合，與其他提取方法相比，該工藝大幅度地減少了樹脂用量，有效地解決了谷氨酰胺在強(qiáng)堿和強(qiáng)酸環(huán)境中的轉(zhuǎn)化問題，生產(chǎn)成本明顯降低。 該方法生產(chǎn) LGln技術(shù)成熟，原材料價(jià)格低廉，廠房設(shè)備以及人力的投入都比較合理，最終產(chǎn)品回收率為 73%，產(chǎn)量高，同時(shí)產(chǎn)品純度高達(dá) 99%，經(jīng)濟(jì)效益高。 根據(jù)投資估算和經(jīng)濟(jì)分析，可知，該生產(chǎn)方法設(shè)計(jì)較為合理。 車間的組成 工廠車間包括發(fā)酵間、反應(yīng)和分離車間、控 制室、更衣室。 生產(chǎn)制度 年操作日 300天 /年，生產(chǎn)方式：發(fā)酵工段為間歇式操作，生產(chǎn)班數(shù)為 3班。 車間內(nèi)水電汽氣等公用工程，輔助工程需要量 生產(chǎn)中需要用蒸汽進(jìn)行預(yù)熱，使用 ℃的蒸汽，由廠外供應(yīng)。生產(chǎn)中需要的冷卻水為自來水， 20℃進(jìn)， 27℃出，可以循環(huán)使用。生產(chǎn)中產(chǎn)生的廢水通過城市污水管網(wǎng)系統(tǒng)送到污水處理廠進(jìn)行集中處理。 電 （ 元 /kW h） 規(guī)格 為 380V， 50Hz。 經(jīng)濟(jì)分析主要結(jié)論 工廠總投資： 萬元 工廠成本： 萬元 增值稅： 萬元 所得稅： 萬元 全年利潤： 萬元 投資回收期：靜態(tài)分析法：（ 1）從國民經(jīng)濟(jì)角度 年 （ 2）從企業(yè)經(jīng)濟(jì)角度 年 動態(tài)分析法：（ 1）從國民經(jīng)濟(jì)角度 年 （ 2）從企業(yè)經(jīng)濟(jì)角度 年 2 文獻(xiàn)評述 簡史概述 L谷氨酰胺 (LGlutamine， LGln)是 L谷氨酸的 γ羧基酰胺化的一種氨基酸，其結(jié)構(gòu)式為 NH2OCCH2CH2CH(NH2)COOH，分子量 ，分解溫度 185 ℃ ，等電點(diǎn) ，屬中性氨基酸。作為 20種構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本氨基酸 之一，谷氨酰胺占全身游離氨基酸 的一半以上，是機(jī)體含量最豐富的氨基酸，在生物體代謝中起著舉足輕重的作用，是一種“ 條件性必需 ” 氨基酸。自 1952年用 X光衍射確定了其分子結(jié)構(gòu)后，對它的應(yīng)用就日益引起人們的關(guān)注，被認(rèn)為是目前所知道的最 重 要的氨基酸之一，也是一種極有發(fā)展前途 常州大學(xué)畢業(yè) 設(shè)計(jì)說明書 第 5 頁 共 27 頁 的新藥 [1]。 LGln是各器官之間氮流動最重要的載體，被稱為氮梭。 LGln是蛋白質(zhì)、核酸、嘌呤、嘧啶、氨基酸、氨基糖、谷胱甘肽等生物分子合成的重要前體 [3~4]，還是腎臟產(chǎn)氨的前體物質(zhì)，對維持酸堿平衡起著至關(guān)重要的作用 [5~6]。 LGln可 以為小腸粘膜細(xì)胞及其它快速生長和分化細(xì)胞提供能源。 LGln還是蛋白質(zhì)代謝的重要調(diào)節(jié)因子，如促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)等生物大分子的合成，減少骨骼肌中蛋白質(zhì)的分解，對于調(diào)節(jié)應(yīng)激狀態(tài)下的細(xì)胞代謝和免疫細(xì)胞的功能具有重要的意義。 工業(yè)生產(chǎn)方法的選擇和論證 LGln的生產(chǎn)方法可分為 3種：化學(xué)合成法、 酶促合成法 和 發(fā)酵法。 化學(xué)合成法 C5H9NO4(Glu) ??????? ?? 423 , SOHOHCH C6H11NO4 ???? ?? 32,NHCS C7H20N4O4S2 ?? ?? 3NH C7H18N4O3S2 ??? ?? HOAc C5H9N2O3(LGln) C5H9NO4(Glu) ??????? ?? 423 , SOHOHCH C6H11NO4 ???? ?? 22NHNH C6H13N3O3 ???? ?? 鎳Raney C6H10N2O3(LGln) 圖 2 化學(xué)法合成 LGln 流程 圖 目前工業(yè)上主要有如圖 1所示兩種化學(xué)合成法生產(chǎn) LGln。由化學(xué)合成法流程圖可見，兩種方法均以 Glu為原料，采用濃硫酸作為必需的催化劑，經(jīng)過多步化學(xué)反應(yīng)合成LGln。主要有兩種方法 :第一種方法是由 Glu甲酯經(jīng)縮合、加成、成鹽、水解、活性炭脫色、重結(jié)晶得成品。另一種方 法是采用 Glu合成甲酯后，與水合肼反應(yīng)得酰肼，再用Raney鎳將其還原為 LGln。合成法使用了大量的化學(xué)試劑，在產(chǎn)品中不同程度的會有所殘留， LGln作為一種口服藥，其純度有較高的要求，使用合成法就限制了產(chǎn)品的質(zhì)量以及使用范圍。而且采用合成法會對環(huán)境造成不良的影響，增加了產(chǎn)品的成本 [7]。 酶促合成法 酶促合成法生產(chǎn) LGln是以 NH4+及谷氨酸作原料，經(jīng) LGln合成酶 (GS)催化而成，如圖 2所示。 OHPiA D PG lnLA T PNHG lu 24 ???? ???? ? GS 圖 3 酶法合成 LGln流程圖 與化學(xué)合成法相比，酶促合成法反應(yīng)步驟相對簡單，其中三磷酸腺 苷 (ATP)是必需的。 ATP價(jià)格昂貴，同時(shí)酶促反應(yīng)底物 NH4+、副產(chǎn)品二磷酸腺苷 (ADP)都明顯抑制 LGln的生成，因此該生產(chǎn)方法不能滿足大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的需要 [8]。 發(fā)酵法 常州大學(xué)畢業(yè) 設(shè)計(jì)說明書 第 6 頁 共 27 頁 發(fā)酵法是目前最常用的 LGln生產(chǎn)方法。 1961年， Tsunoda等 [9]首先發(fā)現(xiàn)，除了 Glu以外，在 Glu發(fā)酵液中還有 LGln； 1963年， Oshima等 [10]通過改變 谷氨酸微球菌的發(fā)酵條件使 Glu發(fā)酵轉(zhuǎn)向 LGln發(fā)酵； 70年代， Nakanishi等 [11~12]進(jìn)一步證實(shí)了，改變發(fā)酵條件可以使 Glu產(chǎn)生菌從 Glu發(fā)酵轉(zhuǎn)向 LGln發(fā)酵。 80年代后，我國在實(shí)驗(yàn)室小試或中試規(guī)模中進(jìn)行了 LGln發(fā)酵法生產(chǎn)，但 LGln產(chǎn)量低 。 1977年， LGln年產(chǎn)量達(dá)到 100 t； 1990年， LGln年產(chǎn)量上升為 1200 t；截止 至 2020年， LGln每年僅用作藥物及健康食品有效成分的需求量就達(dá)到 2020 t；目前世界上只有少數(shù)幾家生產(chǎn) LGln，均采用發(fā)酵法，日本的發(fā)酵水平為 60 g/L，韓國為 50 g/L；我國目前只有少數(shù)幾家以發(fā)酵法生產(chǎn)， 生產(chǎn)規(guī)模較小 ， 生產(chǎn)能力遠(yuǎn)不能滿足市場需求 ，藥品級 LGln主要依賴進(jìn)口。 本設(shè)計(jì)選用發(fā)酵法，具有原料來源廣泛、生產(chǎn)成本低、產(chǎn)品質(zhì)量可控、產(chǎn)物單一等優(yōu)點(diǎn)，適宜于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。 產(chǎn)品的發(fā)展前景 近二十年前，科學(xué)家們只知道 LGln的存在但并不十分了解它的作用。一般將其視為治療消化道潰瘍藥物之一。但是十多年來這種情況有了巨大的改變 [11]。由于一系列的突破性發(fā)現(xiàn)，科學(xué)家們認(rèn)為 LGln是 “ 不可或缺的非必需氨基酸 ” ，它已經(jīng)成為發(fā)展新型藥物、 臨床治療及運(yùn)動營養(yǎng)保健的重要材料。 國內(nèi)的醫(yī)保藥 “ 谷參腸安 ” （四川成都蓉信醫(yī)藥科技有限公司），其主要成分谷氨酰胺，輔之以人參、茯苓等中藥。據(jù)估計(jì)，在消化道系統(tǒng)藥物中谷氨酰胺的用量為 500 t/年以上。 在動物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)新型生化藥物及疫苗方面，谷氨酰胺作為原料，用量（去除熱原的谷氨酰胺）早已超過 1000 t/年，且呈繼續(xù)快速增長趨勢。 在特殊營養(yǎng)保健品方面，谷氨酰胺對保護(hù)肌肉有明顯作用，并能提高人體的激素水平。目前，世界各國已廣泛使用由 L谷氨酰胺、 L精氨酸、 D核糖等配伍而成的運(yùn)動營養(yǎng)制劑，對提高運(yùn)動成 績有著一定的作用。在日本和歐美的發(fā)達(dá)國家把谷氨酰胺結(jié)晶（或粉末）膠囊、片劑或瓶裝飲料作為營養(yǎng)保健品出售，這部分的用量每年約 2020多噸。 綜上所述，該行業(yè)正處于快速成長期，需求量大，有商機(jī)， 最 重要的是，通過設(shè)計(jì)研發(fā)出一種低成本，高產(chǎn)量的工藝流程，滿足不同消費(fèi)群體需求，造福 各個(gè) 收入人群。 3 工藝敘述部分 設(shè)計(jì)的生產(chǎn)方法及生產(chǎn)流程的選擇與論證 生產(chǎn)菌種的選擇與論證 本設(shè)計(jì)以 黃色短桿菌 ATCC14067SGR 突變株 為供試菌 株， 葡萄糖為原料、玉米漿為輔助材料 ，發(fā)酵工段具體為： 以 黃色短桿菌 ATCC14067 為親本菌株， 利用 NTG 對其進(jìn)行 誘變處理 后 ，在不同濃度 SG 的基本培養(yǎng)平板上篩選得到 SG 抗性突變株 [13]。 生產(chǎn)天數(shù) 300 天，共生產(chǎn) 150 個(gè)周期 ， 先將置于斜面培養(yǎng)基培養(yǎng) 的 菌株 加入到一級種子罐中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng) 7 h 的時(shí)間；緊接著將種子液接種到二級培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，接種量 7%，培養(yǎng) 3 h 的時(shí)間；然后接種發(fā)酵罐中進(jìn)行深層液體發(fā)酵，接種量 10%，碳源 常州大學(xué)畢業(yè) 設(shè)計(jì)說明書 第 7 頁 共 27 頁 轉(zhuǎn)化率 %，發(fā)酵 72 h 時(shí)間，得到 LGln 的量為 t。 該方法屬于用 Glu生產(chǎn)菌的代謝調(diào)控突變株生產(chǎn) LGln，是目前較為成熟的生產(chǎn)方法。 一級 種 子培養(yǎng)基組成：葡萄糖 3%~4%，脲 %~%， KH2PO4 %， K2HPO4 3H2O %， MgSO4 7H2O %，玉米漿（ CSL） 3%~4%， ~。 二級 種子培養(yǎng)基組成：葡萄糖 3%~4%，脲 %~%， KH2PO4 %， K2HPO4 3H2O %， MgSO4 7H2O %，玉米漿（ CSL） 3%~4%， ~。 發(fā)酵培養(yǎng)基組成： 葡萄糖 14%， KH2PO4 %， MgSO4 ?7H2O %， MnSO4 ?H2O %， ZnSO4?7H2O %， CuSO4 ?5H2O %， 維生素 B1?HCl %， 玉米漿干粉 %， (NH4)2SO4 %， 泡敵 %。 以 7% (NH4)2SO4為氮源通氣攪拌 ， 發(fā)酵過程中用氨水控制 pH 為 6~7[14]。 分離純化工藝的選擇與論證 本設(shè)計(jì)提取工段具體為： 發(fā)酵料液經(jīng)絮凝過濾處理后進(jìn)行 活性炭脫色 ， 脫色后 進(jìn)行第一次濃縮結(jié)晶，溶解晶體進(jìn)行 電滲析脫鹽 ， 然后 通過 陰離子交換柱進(jìn)行洗脫 ， 洗脫后第二次 濃縮結(jié)晶 ， 接著離心， 固體送入干燥器烘干 ， 母液回流 ， 最后出成品。這套分離純化工藝的總得率是 73%[15]。 提取工段具體為：第一步，將 絮凝后 發(fā)酵料液打入過濾機(jī)進(jìn) 行 凝過濾處理后，用濾液儲罐進(jìn)料泵將濾液泵入濾液貯罐；第二步，用活性炭 脫色 進(jìn)料泵將濾液泵入活性炭柱中進(jìn)行活性炭脫色，并將脫色液存入脫色液貯罐中；第三步，用濃縮結(jié)晶器進(jìn)料泵將洗脫液泵入濃縮結(jié)晶器中，進(jìn)行 第一次 濃縮結(jié)晶 ；第四步， 用電滲析裝置進(jìn)料泵將脫色液泵入電滲析裝置中，將廢液排出管道，電滲析液打入電滲析貯罐中脫鹽；第四步，用陰離子交換柱進(jìn)料泵將脫色液泵入陰離子交換柱中，洗脫液打入洗脫液貯罐中；第 五步，用濃縮結(jié)晶器進(jìn)料泵將洗脫液泵入濃縮結(jié)晶器中，進(jìn)行 第二次 濃縮結(jié)晶；第五步，濃縮結(jié)晶后緊接著用離心機(jī)進(jìn)行離心，將母液用泵泵入母液貯