土壤中產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌的篩選與鑒定和淀粉酶活測(cè)定(編輯修改稿)
2025-06-12 02:53 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 干燥鏡檢。： 將分離的單個(gè)菌落接種至淀粉水解培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)基接種3個(gè)菌落，每種菌接種一個(gè)平板。37℃溫箱中培養(yǎng)24h。記錄并編號(hào)。3048h后，觀察培養(yǎng)基中是否有透明圈產(chǎn)生，挑選有透明圈的聚落則為能產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌。（第五天）： 挑選有透明圈的菌落，再進(jìn)行革蘭氏染色和芽孢染色，驗(yàn)證菌落為紫色，革蘭氏陽(yáng)性菌且有綠色芽孢出現(xiàn)。以致確定其具有芽孢，為芽孢桿菌。 涂片干燥固定初染（加草酸銨結(jié)晶紫染液12min后，倒去沖洗至無(wú)色）媒染（碘液沖去涂面1min，水洗）脫色（95％酒精，25s，立即沖洗）復(fù)染（番紅染液1min，水洗吸干）鏡檢。 涂片干燥固定加溫染色（加5％孔雀綠染色，微火加熱至冒蒸汽維持5min）冷卻水洗（至無(wú)色）復(fù)染（加番紅染色2min，水洗吸干）油鏡鏡檢。(芽孢染色要培養(yǎng)30h，我們直接從鑒定淀粉水解酶的培養(yǎng)基中挑出菌進(jìn)行了芽孢染色)。在不同培養(yǎng)基中挑選所得滿(mǎn)足條件的菌種并編號(hào)A、B、C......假設(shè)一共n種菌。接種至斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，每種菌接種兩支試管，一支保存，一支進(jìn)行各項(xiàng)生化鑒定。37℃溫箱中培養(yǎng)24h。標(biāo)明菌種產(chǎn)地。：：：從各試管斜面培養(yǎng)基上取菌種重新接種到新的平板上，37℃溫箱中培養(yǎng)24h。觀察其形態(tài)特征（大小、顏色、干濕、邊緣、質(zhì)地、氣味、是否易被挑起） 單染色（桿狀，排列方式，大小） 革蘭氏染色（陽(yáng)性）芽孢染色（菌體染成紫色，芽孢為綠色，產(chǎn)孢位置，大小等） pH=：==(其中pH=） ℃溫箱中培養(yǎng)24h“＋”表示，代表該菌能耐酸，反之“”?！鏈叵渲信囵B(yǎng)24h，充分振蕩，使吲哚萃取到乙醚中，靜置分層，然后沿管壁加入10d吲哚試劑，若有吲哚存在，則乙醚層顯玫瑰紅色，為陽(yáng)性，用“＋”表示，反之用“”。 VP試驗(yàn)℃溫箱中培養(yǎng)24h％NaOH溶液1020d，再加入等量ɑ酚萘在37℃溫箱中保留15min，若培養(yǎng)液變紅，則為陽(yáng)性，用“＋”表示，反之。（產(chǎn)酸產(chǎn)氣）、木糖、甘露醇、阿拉伯糖發(fā)酵水培養(yǎng)液中（杜氏小管)(各糖含量為1％）℃溫箱中培養(yǎng)24h，則產(chǎn)酸，若杜氏小管中有氣泡，則產(chǎn)氣(整個(gè)過(guò)程中不能人為制造氣泡)，冷卻至室溫，與酪氨酸混勻制成平板，置37℃溫箱中培養(yǎng)24h℃溫箱中培養(yǎng)24h， 將接種針從直立柱培養(yǎng)基中央自 上而下直刺到離管底 處，沿原穿刺線(xiàn)拔出接種針 37℃恒溫箱培養(yǎng) 24h。，若有，則菌株有鞭毛，但是如果是需氧型的話(huà)會(huì)在培養(yǎng)基表面上形成一薄膜；若是不會(huì)運(yùn)動(dòng)的細(xì)菌，培養(yǎng)基中的穿刺線(xiàn)很清晰，直立生長(zhǎng)，則無(wú)鞭毛?！鏈叵渲信囵B(yǎng)24h，則表明能利用檸檬酸鹽作為碳源生長(zhǎng)，以“+”表示。若培養(yǎng)基為綠色則為陰性，以“—”表示。（連續(xù)培養(yǎng)觀察大約一星期左右為宜）％,5％,7％,10％鹽濃度梯度的培養(yǎng)基(用營(yíng)養(yǎng)瓊脂再加氯化鈉即可)℃溫箱中培養(yǎng)24h，觀察并比較菌落長(zhǎng)勢(shì)℃,25℃,45℃,37℃,60℃的溫度梯度，深度至明膠層2/3處，觀察是否被細(xì)菌液化，如被液化，則為陽(yáng)性，能產(chǎn)生蛋白酶0123456麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（ml）0蒸餾水（mL）0、乙液等量混合后（ mL）加入培養(yǎng)基內(nèi)，立即觀察結(jié)果若呈現(xiàn)紅色則為陽(yáng)性“+”，若無(wú)紅色出現(xiàn)則為陰性“”，產(chǎn)生白色圓圈表示卵磷脂分解生成脂肪，說(shuō)明有卵磷脂酶。用“＋”表示有透明圈，反之“”。％的無(wú)菌溶菌酶母液％的培養(yǎng)基℃溫箱24h培養(yǎng)，觀察若肉湯澄清則被溶菌酶抑制，用“”表示，渾濁則不被溶菌酶抑制，用“+”表示，并固定干燥，能夠產(chǎn)生起泡的菌種能夠產(chǎn)過(guò)氧化氫酶，用“+”表示，反之則用“”。根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》及各個(gè)鑒定項(xiàng)目的結(jié)果，給所挑選的菌株鑒定到種 +100mL蒸餾水，5－二硝基水楊酸試劑2ml,沸水浴準(zhǔn)確煮沸5min，取出冷卻，用蒸餾水稀釋至20ml，記錄吸光值，麥芽糖含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。 發(fā)酵液的制備，選擇一個(gè)菌株，接三環(huán)菌種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)，160 rpm/min , 37 ℃，48 h后，取1ml發(fā)酵液于離心管中，4000 rpm/min離心10 min，收集上清液，加1%淀粉溶液1mL、緩沖液3mL，于60℃水浴中預(yù)熱5min，于60℃水浴中保溫30min，沸水浴5min，迅速冷卻，加蒸餾水定容至20 mL。 加發(fā)酵液后加濃鹽酸至pH=，使酶失活，其余步驟同上，搖勻，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)520nm處進(jìn)行比色，記錄吸光值，從麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中查出麥芽糖含量，然后進(jìn)行結(jié)果計(jì)算結(jié)果計(jì)算。從土樣1中分離出3個(gè)菌株，經(jīng)過(guò)鏡檢判斷均已純化，分別標(biāo)記為1A,1B,1C從土樣2中分離出4個(gè)菌株，經(jīng)過(guò)鏡檢判斷均已純化，分別標(biāo)記為2A,2B,2C,2D1A1B1C2A2B2C2D淀粉酶+++++革蘭氏+++++芽孢+++++“+”表示產(chǎn)淀粉酶/芽孢/陽(yáng)性，反之“”，無(wú)淀粉酶的菌株不做芽孢染色觀察編號(hào)1A個(gè)體較小，短桿狀，排列散落，單個(gè)或短鏈狀菌落白色略透明，菌落中等，表面光滑，非常濕潤(rùn)，有光澤，邊緣整齊，易挑起產(chǎn)孢情況孢子端生，多游離，不膨大編號(hào)1B個(gè)體較小，短桿或近橢圓，多短鏈狀排列菌落淺黃
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