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正文內(nèi)容

土壤中產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌的篩選與鑒定和淀粉酶活測定(編輯修改稿)

2025-06-12 02:53 本頁面
 

【文章內(nèi)容簡介】 干燥鏡檢。: 將分離的單個菌落接種至淀粉水解培養(yǎng)基上,每個培養(yǎng)基接種3個菌落,每種菌接種一個平板。37℃溫箱中培養(yǎng)24h。記錄并編號。3048h后,觀察培養(yǎng)基中是否有透明圈產(chǎn)生,挑選有透明圈的聚落則為能產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌。(第五天): 挑選有透明圈的菌落,再進行革蘭氏染色和芽孢染色,驗證菌落為紫色,革蘭氏陽性菌且有綠色芽孢出現(xiàn)。以致確定其具有芽孢,為芽孢桿菌。 涂片干燥固定初染(加草酸銨結(jié)晶紫染液12min后,倒去沖洗至無色)媒染(碘液沖去涂面1min,水洗)脫色(95%酒精,25s,立即沖洗)復(fù)染(番紅染液1min,水洗吸干)鏡檢。 涂片干燥固定加溫染色(加5%孔雀綠染色,微火加熱至冒蒸汽維持5min)冷卻水洗(至無色)復(fù)染(加番紅染色2min,水洗吸干)油鏡鏡檢。(芽孢染色要培養(yǎng)30h,我們直接從鑒定淀粉水解酶的培養(yǎng)基中挑出菌進行了芽孢染色)。在不同培養(yǎng)基中挑選所得滿足條件的菌種并編號A、B、C......假設(shè)一共n種菌。接種至斜面培養(yǎng)基上進行擴增培養(yǎng),每種菌接種兩支試管,一支保存,一支進行各項生化鑒定。37℃溫箱中培養(yǎng)24h。標(biāo)明菌種產(chǎn)地。:::從各試管斜面培養(yǎng)基上取菌種重新接種到新的平板上,37℃溫箱中培養(yǎng)24h。觀察其形態(tài)特征(大小、顏色、干濕、邊緣、質(zhì)地、氣味、是否易被挑起) 單染色(桿狀,排列方式,大?。?革蘭氏染色(陽性)芽孢染色(菌體染成紫色,芽孢為綠色,產(chǎn)孢位置,大小等) pH=:==(其中pH=) ℃溫箱中培養(yǎng)24h“+”表示,代表該菌能耐酸,反之“”?!鏈叵渲信囵B(yǎng)24h,充分振蕩,使吲哚萃取到乙醚中,靜置分層,然后沿管壁加入10d吲哚試劑,若有吲哚存在,則乙醚層顯玫瑰紅色,為陽性,用“+”表示,反之用“”。 VP試驗℃溫箱中培養(yǎng)24h%NaOH溶液1020d,再加入等量ɑ酚萘在37℃溫箱中保留15min,若培養(yǎng)液變紅,則為陽性,用“+”表示,反之。(產(chǎn)酸產(chǎn)氣)、木糖、甘露醇、阿拉伯糖發(fā)酵水培養(yǎng)液中(杜氏小管)(各糖含量為1%)℃溫箱中培養(yǎng)24h,則產(chǎn)酸,若杜氏小管中有氣泡,則產(chǎn)氣(整個過程中不能人為制造氣泡),冷卻至室溫,與酪氨酸混勻制成平板,置37℃溫箱中培養(yǎng)24h℃溫箱中培養(yǎng)24h, 將接種針從直立柱培養(yǎng)基中央自 上而下直刺到離管底 處,沿原穿刺線拔出接種針 37℃恒溫箱培養(yǎng) 24h。,若有,則菌株有鞭毛,但是如果是需氧型的話會在培養(yǎng)基表面上形成一薄膜;若是不會運動的細(xì)菌,培養(yǎng)基中的穿刺線很清晰,直立生長,則無鞭毛?!鏈叵渲信囵B(yǎng)24h,則表明能利用檸檬酸鹽作為碳源生長,以“+”表示。若培養(yǎng)基為綠色則為陰性,以“—”表示。(連續(xù)培養(yǎng)觀察大約一星期左右為宜)%,5%,7%,10%鹽濃度梯度的培養(yǎng)基(用營養(yǎng)瓊脂再加氯化鈉即可)℃溫箱中培養(yǎng)24h,觀察并比較菌落長勢℃,25℃,45℃,37℃,60℃的溫度梯度,深度至明膠層2/3處,觀察是否被細(xì)菌液化,如被液化,則為陽性,能產(chǎn)生蛋白酶0123456麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(ml)0蒸餾水(mL)0、乙液等量混合后( mL)加入培養(yǎng)基內(nèi),立即觀察結(jié)果若呈現(xiàn)紅色則為陽性“+”,若無紅色出現(xiàn)則為陰性“”,產(chǎn)生白色圓圈表示卵磷脂分解生成脂肪,說明有卵磷脂酶。用“+”表示有透明圈,反之“”。%的無菌溶菌酶母液%的培養(yǎng)基℃溫箱24h培養(yǎng),觀察若肉湯澄清則被溶菌酶抑制,用“”表示,渾濁則不被溶菌酶抑制,用“+”表示,并固定干燥,能夠產(chǎn)生起泡的菌種能夠產(chǎn)過氧化氫酶,用“+”表示,反之則用“”。根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌學(xué)手冊》及各個鑒定項目的結(jié)果,給所挑選的菌株鑒定到種 +100mL蒸餾水,5-二硝基水楊酸試劑2ml,沸水浴準(zhǔn)確煮沸5min,取出冷卻,用蒸餾水稀釋至20ml,記錄吸光值,麥芽糖含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 發(fā)酵液的制備,選擇一個菌株,接三環(huán)菌種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,搖床培養(yǎng),160 rpm/min , 37 ℃,48 h后,取1ml發(fā)酵液于離心管中,4000 rpm/min離心10 min,收集上清液,加1%淀粉溶液1mL、緩沖液3mL,于60℃水浴中預(yù)熱5min,于60℃水浴中保溫30min,沸水浴5min,迅速冷卻,加蒸餾水定容至20 mL。 加發(fā)酵液后加濃鹽酸至pH=,使酶失活,其余步驟同上,搖勻,用分光光度計在波長520nm處進行比色,記錄吸光值,從麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出麥芽糖含量,然后進行結(jié)果計算結(jié)果計算。從土樣1中分離出3個菌株,經(jīng)過鏡檢判斷均已純化,分別標(biāo)記為1A,1B,1C從土樣2中分離出4個菌株,經(jīng)過鏡檢判斷均已純化,分別標(biāo)記為2A,2B,2C,2D1A1B1C2A2B2C2D淀粉酶+++++革蘭氏+++++芽孢+++++“+”表示產(chǎn)淀粉酶/芽孢/陽性,反之“”,無淀粉酶的菌株不做芽孢染色觀察編號1A個體較小,短桿狀,排列散落,單個或短鏈狀菌落白色略透明,菌落中等,表面光滑,非常濕潤,有光澤,邊緣整齊,易挑起產(chǎn)孢情況孢子端生,多游離,不膨大編號1B個體較小,短桿或近橢圓,多短鏈狀排列菌落淺黃
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