產(chǎn)漆酶菌株的篩選與酶活性的測定論(編輯修改稿)
2025-02-11 00:47 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 min。 種子培養(yǎng)基 土豆200g/L，葡萄糖20g/L，pH自然，120℃滅菌20min。 發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖20g/L，酒石酸銨10g/L，磷酸二氫鉀 2g/L，，pH自然，120℃滅菌20min。 菌種保藏斜面培養(yǎng)基 土豆200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L，pH自然，120℃滅菌20min。 實驗方法 產(chǎn)漆酶菌株的篩選 平板初篩 將從南昌農(nóng)藥廠采取的土壤樣品分別稱量5g梯度稀釋到107涂布到PDA篩選培養(yǎng)基進行培養(yǎng)（梯度稀釋到103 菌株才會再生長）。取1ml土壤稀釋液均勻涂布在含有愈創(chuàng)木酚(或a萘酚）的PDA培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)7天，或者直接挑取少量土壤接種于含有愈創(chuàng)木酚(或a萘酚）的PDA培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)7天。待菌株生長出后，挑取周邊有紅色（紫色）變色圈（菌株分泌的胞外漆酶能使以愈創(chuàng)木酚為底物進行氧化，形成鮮艷、均勻的紅色氧化帶,并且菌株顏色深淺、帶寬能較好地反應(yīng)漆酶活性）的菌落劃線分離。將分離后的能產(chǎn)生變色圈的菌株重新接種至新的平板，對菌株進行了重復(fù)篩選，通過劃線分離4次篩選出單菌落，根據(jù)菌落顏色的深淺和變色圈的大小可以初步篩選出產(chǎn)漆酶活力較高的菌株。 搖瓶復(fù)篩 在超凈工作臺中無菌操作，進行接種。用接種環(huán)從長滿菌絲的平板上挑取少量菌絲接入種子培養(yǎng)基（50ml/250ml），28℃、200r/min搖床恒溫培養(yǎng)48h，取菌懸液接入發(fā)酵培養(yǎng)基（50ml/250ml），接種量為3ml/瓶，28℃、200r/min搖床恒溫培養(yǎng)7d。 漆酶液態(tài)發(fā)酵及其制備將初步篩選的菌株用接種環(huán)從長滿菌落的平板中挑取長勢較好的單菌落接入種子培養(yǎng)基（50ml/250ml），28℃、200rpm搖床恒溫培養(yǎng)48h，取菌懸液接入液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基（50ml/250ml），接種量為3ml/瓶，28℃、200pm搖床恒溫培養(yǎng)7d。在發(fā)酵的過程中對其進行漆酶活性的測定，取出其發(fā)酵液，4℃、10000rpm離心3min，留取上清液，即為粗酶液，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩? 漆酶酶活性的測定 ABTS分光光度計法以ABTS為底物測定漆酶酶活是目前國外最為常見的方法之一[]。它有如下優(yōu)點：（1） ABTS易溶于水，在室溫下放置6個月仍比較穩(wěn)定。（2） 在漆酶的作用下，ABTS有色溶液的摩爾吸光系數(shù)比較高，說明以其為底物測定的靈敏度也較高。（3） 其反應(yīng)只有一步，ABTS的陽離子自由基比較穩(wěn)定，通常在幾個小時或者幾天內(nèi)是穩(wěn)定的，并且它在水溶液中為淺藍色。（4） 迄今為止，還沒有報道稱ABTS有誘變作用、致癌作用，或者有強烈的毒性。一般以ABTS作為底物，采用乙酸乙酸鈉緩沖體系、檸檬酸鹽磷酸鹽緩沖體系或者GlycineHcl緩沖體系。倘若菌株產(chǎn)生過氧化氫，為了保證測定準(zhǔn)確性，需要破壞過氧化氫，應(yīng)加入一定量的過氧化氫酶。因為菌株在生長代謝過程中，自身會產(chǎn)生過氧化氫激發(fā)木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶對ABTS的氧化。 分光光度法具體步驟，加入HAcNaAc（），混勻，加入ABTS ，放置30s，每15s讀取一次420nm下的吸光值。共讀取67個數(shù)值。以往實驗判斷，如果吸光值增長迅速，需要將酶液稀釋25倍再次測定，直至吸光值數(shù)值變化不是太快。 酶活性的計算酶活=吸光度變化的斜率4000稀釋倍數(shù)酶活單位：漆酶活單位定義為1國際單位（1U）等于每分鐘氧化1umol底物或生成1umol產(chǎn)物的酶量。3 菌株的活化 培養(yǎng)基及主要試劑的配置（1） MRS培養(yǎng)基（g/L）：，，，，吐溫80 ，，；（2） TE緩沖液：稱Triscl ，EDTA ， 再定容至1000ml，高溫滅菌即可。（3）裂解緩沖液：稱Triscl ，EDTA ，，最后定容至1000ml，高溫滅菌即可。（4）CTAB緩沖液：稱Triscl ，EDTA ，CTAB 20g,NaCl ,，最后定容至1000ml，高溫滅菌即可。（5）TBE(5）：稱Tris 54g，EDTA ，加蒸餾水溶解調(diào)pH,，即可。（6）3mol/ml的醋酸鈉緩沖液：，超純水100ml，4℃保存?zhèn)溆谩? 菌種活化步驟將產(chǎn)漆酶高的系列1保藏菌種接種于MRS培養(yǎng)基中，2%接種量接種于MRS培養(yǎng)基，30℃ 、200r/min搖床培養(yǎng)一天，活化二次，此活化的菌株再照改良CTAB法提取全基因組。4 改良CTAB法提取待測菌株全基因組[] 基因組提取（
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