產(chǎn)漆酶菌株的篩選與酶活性的測定論-全文預(yù)覽
【正文】 社, [8]張敏,肖亞中,王怡平等。1微生物學(xué)報(bào),2000,40(6):6286321[5]初華麗，梁宗琦，韓燕峰。參考文獻(xiàn)[1]Couto S R,Herrera J L and bioteachnological applications of Laccases:A review[J].Bioteachnology Advance,2006,24:500513[2]Riva S Laccases:blue enzymes for green chemistry[J].Trends,in Biotechnology,2006,24(5):219226[3]王佳玲,余惠生,付時(shí)雨等。在采集來的土壤中能夠產(chǎn)漆酶的菌株本身就甚少，同時(shí)增加了篩選的困難。實(shí)驗(yàn)結(jié)果非常直觀，大大縮短了篩選時(shí)間和篩選工作量。6 討論和小結(jié)1. 討論 在整個(gè)篩菌過程中需要保證無菌操作，避免雜菌的污染。在測漆酶活的過程中。適宜的培養(yǎng)條件：50ml/250ml發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為3ml，培養(yǎng)溫度為28℃，轉(zhuǎn)速為200r/min，培養(yǎng)時(shí)間為7d。如圖1為在加愈創(chuàng)木酚的PDA培養(yǎng)基平板上的正反面照片。 用改良CTAB法提取待測菌株全基因組后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外照射下可以看到DNA電泳圖譜，檢測提取的DNA樣品，TE 20ul保存?zhèn)溆谩＃?） 重復(fù)上述步驟。（2） 加入200ul裂解液（含10mg/ml溶菌酶），15U變?nèi)芫?，用移液槍反?fù)吹打，使菌體均勻懸浮，37℃保溫3h，期間每隔30min搖勻一次。（5）TBE(5）：稱Tris 54g，EDTA ，加蒸餾水溶解調(diào)pH,，即可。 酶活性的計(jì)算酶活=吸光度變化的斜率4000稀釋倍數(shù)酶活單位：漆酶活單位定義為1國際單位（1U）等于每分鐘氧化1umol底物或生成1umol產(chǎn)物的酶量。因?yàn)榫暝谏L代謝過程中，自身會(huì)產(chǎn)生過氧化氫激發(fā)木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶對(duì)ABTS的氧化。（3） 其反應(yīng)只有一步，ABTS的陽離子自由基比較穩(wěn)定，通常在幾個(gè)小時(shí)或者幾天內(nèi)是穩(wěn)定的，并且它在水溶液中為淺藍(lán)色。在發(fā)酵的過程中對(duì)其進(jìn)行漆酶活性的測定，取出其發(fā)酵液，4℃、10000rpm離心3min，留取上清液，即為粗酶液，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩⒎蛛x后的能產(chǎn)生變色圈的菌株重新接種至新的平板，對(duì)菌株進(jìn)行了重復(fù)篩選，通過劃線分離4次篩選出單菌落，根據(jù)菌落顏色的深淺和變色圈的大小可以初步篩選出產(chǎn)漆酶活力較高的菌株。 菌種保藏斜面培養(yǎng)基 土豆200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L，pH自然，120℃滅菌20min。3mol/ml的醋酸鈉緩沖液：，超純水100ml，4℃保存?zhèn)溆谩? 實(shí)驗(yàn)設(shè)備及主要試劑：LDZX—50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠PHS3C型雷磁PH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司LRH250A型生化培養(yǎng)箱 韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司SW—CJ—2G型雙人凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司UU765型紫外可見分光光度計(jì): 上海精密科學(xué)儀器有限公司 JW—3022HR型高速冷凍離心機(jī) 安徽嘉文儀器裝備有限公司101—2型干燥箱 上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠SPY50型雙層培養(yǎng)搖床 上海市離心機(jī)械研究所愈創(chuàng)木酚：2甲氧基酚ABTS：2,2’連氮基雙（ 3乙基苯丙噻唑啉6磺酸）HACNaAc()緩沖液TE緩沖液：稱Triscl ，EDTA ， 再定容至1000ml，高溫滅菌即可。我們從南昌農(nóng)藥廠采集不同
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