【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 4）完善與開發(fā)新的分離技術(shù) 徑向色譜采用了徑向流動(dòng)技術(shù)，即樣品和流動(dòng)相從柱的圓周圍流向圓心，流速比軸向流動(dòng)可增加34倍，保持柱直徑不變時(shí)只增加柱長(zhǎng)，就可線性增大樣品處理量，這就解決了傳統(tǒng)軸向色譜放大難的問題。再如，傳統(tǒng)的色譜多孔介質(zhì)孔內(nèi)為擴(kuò)散傳質(zhì)，傳質(zhì)阻力大是提高分離效率的重要制約因素，尤其是在高流速下。灌注色譜則以對(duì)流傳質(zhì)為特征傳質(zhì)快，高流速仍能獲得高柱效。還有，電泳技術(shù)盡管可靠性與分辨率都可與高壓液相色譜競(jìng)爭(zhēng)，但是容量太小，一直用十分析。無(wú)載體連續(xù)流動(dòng)電泳的出現(xiàn)則有望使電泳這一高效分離技術(shù)在工業(yè)化制備中發(fā)揮重要作用。 酶的結(jié)構(gòu)和功能是緊密聯(lián)系在一起的，酶分子必須形成特定的二維結(jié)構(gòu)(即天然折疊結(jié)構(gòu))，才能實(shí)現(xiàn)其特定的生命功能。酶能否形成并穩(wěn)定在其天然折疊結(jié)構(gòu)，決定于酶蛋白中各組分之間的相互作用。酶蛋白中的主鏈原子是通過化學(xué)鍵連接成長(zhǎng)鏈的。但是，化學(xué)鍵結(jié)合強(qiáng)度很大，一般的熱擾動(dòng)對(duì)它影響很小。因此，對(duì)酶蛋白的折疊結(jié)構(gòu)起決定作用的主要是酶蛋白分子中各原子間的非鍵作用[16]：氫鍵、離子鍵、疏水相互作用、范德華力、二硫鍵。它們的鍵雖然弱，但它們相互作用的數(shù)量大，疊加在一起就成為維持和穩(wěn)定蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的不可忽視的作用力。在制備、分離純化、儲(chǔ)運(yùn)及使用過程中，一些難以避免的因素如溫度、pH、鹽濃度變化以及攪拌等都有可能改變酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)，從而造成酶的失活。因此，增強(qiáng)β甘露聚糖酶的穩(wěn)定性對(duì)提高產(chǎn)品收率具有重要意義。 β甘露聚糖酶可降解由瓜膠、改性瓜膠以及魔芋膠等制成的石油壓裂液，提高壓裂液的返排率，利于石油鉆采工業(yè)。 己有研究表明將β甘露聚糖酶應(yīng)用于石油破膠技術(shù)取得相應(yīng)成效[17]，如諾卡氏菌形放線菌產(chǎn)生的β甘露聚糖酶用于低溫(30～60℃)油井壓裂液的生物破膠劑，具有效率高、成本低、對(duì)地層傷害小以及配膠工藝簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)，很好的解決了我國(guó)低溫油井壓裂液的破膠難題。另外，中科院微生物所、遼河油田井下公司和山東沂水酶制劑廠聯(lián)合將β甘露聚糖酶制劑用于低溫油井破膠，也取得了突破性進(jìn)展。 甘露聚糖因其易在畜禽腸道內(nèi)形成高粘度膠體從而影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，因此被稱為抗?fàn)I養(yǎng)因子。β甘露聚糖酶能有效地分解飼料中的β甘露聚糖，去除飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)[18]。不僅如此，在飼料中添加β甘露聚糖酶還可提高飼料的消化率。降解產(chǎn)物甘露寡糖能改善腸道微生態(tài)環(huán)境，提高動(dòng)物免疫功能。此外，飼料中添加β甘露聚糖酶還可降低畜禽糞便中有機(jī)物、氮和磷等的排放量，減少對(duì)環(huán)境的污染。因此，β甘露聚糖酶作為一種綠色飼料添加劑被廣泛應(yīng)用。 β甘露聚糖酶為內(nèi)切型酶，利用其該性質(zhì)可從豆類植物種子中提煉植物油，降低咖啡、巧克力及可可液的粘性以利于進(jìn)一步加工而不減損其風(fēng)味[19]。除此，β甘露聚糖酶還可降解植物膠從而生產(chǎn)功能性低聚糖，其在食品的加工、貯藏和果汁澄清等方面的應(yīng)用愈加廣泛。 內(nèi)切β甘露聚糖酶能水解含甘露聚糖的植物膠，產(chǎn)物為含有不同糖分子(2～10個(gè))組成的低聚糖，它是一種功能性寡糖[20,21]。甘露寡糖不僅可以被機(jī)體吸收，還能有效地降低人的膽固醇水平，減輕便秘，降低血糖，增加腸內(nèi)雙岐桿菌和乳酸菌的生長(zhǎng)，從而增強(qiáng)人體的免疫力。國(guó)內(nèi)外現(xiàn)己將其廣泛用作食品添加劑，或直接用作保健食品食用。 β甘露聚糖酶是半纖維素酶，它與其它半纖維素酶協(xié)同作用，能有效地去除紙漿中的半纖維素，明顯改善紙質(zhì)。Francoise等報(bào)道[22,23]，β甘露聚糖酶可與木聚糖酶共同應(yīng)用于造紙工業(yè)上的軟木漿漂白工藝中，可得到比單純用氯漂白和堿提取過程更好的紙漿特性。用β甘露聚糖酶替代氯和堿還可降低由它們帶來(lái)的環(huán)境污染問題。 β甘露聚糖酶在紡織工業(yè)中用作天然纖維中半纖維素膠質(zhì)降解[24]，并能有效地除去紡織印染產(chǎn)品上粘附的多余燃料以取代常規(guī)化學(xué)處理工藝，降低了能耗和對(duì)環(huán)境的污染。 β甘露聚糖酶作為工具酶用于對(duì)天然多糖類物質(zhì)糖鏈結(jié)構(gòu)的分析。復(fù)雜糖類或糖蛋白的糖鏈中常有甘露糖昔鍵存在[25,26]，因此利用β甘露聚糖酶水解其中的甘露多糖類物質(zhì)，并測(cè)定水解產(chǎn)物中多糖類物質(zhì)的種類和比例，從而可推測(cè)其多糖結(jié)構(gòu)。因此β甘露聚糖酶作為一種工具酶類，在糖工程、糖結(jié)構(gòu)分析及植物基因工程等生物基礎(chǔ)研究中有重要應(yīng)用。 近年來(lái)隨著對(duì)自然界半纖維素資源的開發(fā)、飼糧中β甘露聚糖抗?fàn)I養(yǎng)因子的消除以及甘露低聚糖藥用價(jià)值的發(fā)現(xiàn)，使人們對(duì)高產(chǎn)β甘露聚糖酶菌株的選育和發(fā)酵工藝、酶蛋白的特性、酶基因的克隆和表達(dá)均產(chǎn)生了興趣。 我國(guó)對(duì)微生物β甘露聚糖酶的研究工作早期主要集中在生產(chǎn)菌種的篩選、誘變，酶的誘導(dǎo)、分離純化及性質(zhì)，酶水解底物方式，以及應(yīng)用等方面，相關(guān)的論文已有多篇，其中研究最為詳細(xì)的要數(shù)細(xì)菌中的芽抱桿菌[27,28]。進(jìn)入90年代后，隨著基因工程技術(shù)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)的廣泛應(yīng)用，越來(lái)越多的工作集中在酶基因的克隆表達(dá)和活性位點(diǎn)的研究方面，但目前成熟的報(bào)道還不多。 本課題組篩選了一株高產(chǎn)的中性β甘露聚糖酶的甘露聚糖酶液體發(fā)酵菌株，并對(duì)其產(chǎn)酶的發(fā)酵工藝及純化酶性質(zhì)做了較深入的研究該酶具有在多變的環(huán)境中活力高、穩(wěn)定性好等特性，并具有一定的耐熱穩(wěn)定性，為實(shí)現(xiàn)β甘露聚糖酶的工業(yè)化生產(chǎn)和在飼料中的廣泛應(yīng)用打下了基礎(chǔ)[29,30]。作為一種飼料用酶品種，有必要對(duì)其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能作進(jìn)一步的研究。其研究成果，無(wú)論在理論上還是在實(shí)際應(yīng)用上都將推動(dòng)國(guó)內(nèi)β甘露聚糖酶的研究進(jìn)展。 本文在前期研究的基礎(chǔ)之上，擬解決如下問題: 1)不同溫度條件下芽孢桿菌所產(chǎn)的甘露聚糖酶的穩(wěn)定性。探索酶液的最佳儲(chǔ)存溫度。 2)將發(fā)酵液離心去除菌體，之后采用反復(fù)凍融測(cè)定在不斷凍融的情況下酶液的酶活穩(wěn)定性，為研究酶學(xué)性質(zhì)打下了基礎(chǔ)。 3)將芽孢桿菌產(chǎn)的甘露聚糖酶分裝在透析袋中，撒上PGE將酶液濃縮至不同的倍數(shù)。研究濃縮酶在儲(chǔ)存工程中的最佳濃縮倍數(shù)以及穩(wěn)定性。 4)利用DNS法，對(duì)β甘露聚糖酶穩(wěn)定性進(jìn)行分析。 5)將酶液與各種濃度的添加劑等體積混合，在此基礎(chǔ)上研究哪種添加劑對(duì)甘露聚糖酶的穩(wěn)定性起到最好的保護(hù)作用，便于儲(chǔ)存運(yùn)輸，以提高終產(chǎn)品穩(wěn)定性。 本文的研究思路是以β甘露聚糖酶的分離純化與穩(wěn)定性分析為研究重點(diǎn):通過優(yōu)化儲(chǔ)存條件，進(jìn)行對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行多級(jí)分離純化以實(shí)現(xiàn)高純酶的制備。采用DNS技術(shù)，對(duì)β甘露聚糖酶的穩(wěn)定性進(jìn)行分析預(yù)測(cè)以提高酶液在儲(chǔ)存過程中的穩(wěn)定性。 第二章 枯草芽孢桿菌β甘露聚糖酶的產(chǎn)生及性質(zhì) 數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠 多功能電磁爐 廣東美的生活電器制造有限公司 恒溫?fù)u床 太倉(cāng)市科教器材廠 電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙維爾康湘鷹離心機(jī)有限公司 紫外可見分光光度計(jì) 龍尼柯儀器有限公司 潔凈工作臺(tái) 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠 高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠 電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠 魔芋粉 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司 蛋白胨 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司 酵母浸粉 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司 硫酸鎂 天津市標(biāo)準(zhǔn)科技有限公司 氯化鉀 天津市大茂化學(xué)試劑廠 磷酸氫二鉀 天津市化學(xué)試劑三廠 硝酸鈉 天津市大茂化學(xué)試劑廠 氯化鈉 天津市廣成化學(xué)試劑有限公司 刺槐豆膠（阿拉?。﹪?guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 3,5—二硝基水楊酸 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 氫氧化鈉 天津市廣成化學(xué)試劑有限公司 酒石酸鉀鈉 天津市廣成化學(xué)試劑有限公司 苯酚 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司 無(wú)水亞硫酸氫鈉 天津市紅巖化學(xué)試劑廠 明膠 天津市廣成化學(xué)試劑有限公司 無(wú)水乙醇 天津市廣成化學(xué)試劑有限公司 葡萄糖 濰坊盛泰藥業(yè)有限公司 聚乙二醇（6000） 天津市大茂化學(xué)試劑廠 海藻酸鈉 永嘉精細(xì)化工二廠 D甘露糖 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 苯甲酸鈉 天津市廣成化學(xué)試劑有限公司 山梨酸鉀 天津市廣成化學(xué)試劑有限公司 EDTA 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 移液器 上