蠟樣芽孢桿菌突變體關(guān)于分泌淀粉酶的研究畢業(yè)論文(編輯修改稿)
2024-07-25 21:08 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 2 材料與方法 供試材料 供試菌株 菌種09。由河南大學(xué)實(shí)驗(yàn)室從健康小麥體內(nèi)分離得到，09為蠟樣芽孢桿菌。菌株保存于70℃ 超低溫冰箱。 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：蛋白胨 ，酵母提取物 5g， g，蒸餾水1000mL。一部分加入2%（w/w）瓊脂用來(lái)制備固體LB培養(yǎng)基，另一部分制備液體LB培養(yǎng)基。滅菌條件：121℃ 、?！ 〉矸叟囵B(yǎng)基：可溶性淀粉 ,加熱至淀粉溶解，蛋白胨 ,牛肉膏 ,定容至1000 mL，加入2%（w/w）瓊脂制備固體淀粉培養(yǎng)基。滅菌條件：121℃ 、?！ ?所用試劑 （1） 盧戈氏碘液 碘化鉀 ③蒸餾水 60mL ?。?） 紅霉素 ?。?） 卡那霉素 小試管 EP管 水浴箱 平皿 槍頭 搖床 滴管 牙簽 涂布棒 接種環(huán) 實(shí)驗(yàn)方法 菌株活化 配制LB液體培養(yǎng)基，滅菌三角瓶，200 mL LB液體培養(yǎng)基中接入取70℃冰箱中保存的09 20μL，放入搖床，30℃ 200rpm下培養(yǎng)24h?！ ? 配制LB固體培養(yǎng)基，倒平板。用無(wú)菌水稀釋菌懸液至10106濃度。吸取2 mL 106濃度的菌懸液涂布到平板上，一定要涂布均勻。將培養(yǎng)箱升溫至46℃，將倒好的平板放入培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)座10小時(shí)。 配制LB固體培養(yǎng)基，100 mL培養(yǎng)基中加入卡那霉素50μL，另外100 mL培養(yǎng)基中加入紅霉素20μL，分別搖勻，倒平板，分別標(biāo)明Erm1Kan15。用滅菌好的牙簽挑取單菌落，先在紅霉素的平板上接種，然后在卡那霉素的平板上的相應(yīng)位置接種。將接種好的平板放入30℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36小時(shí)。將培養(yǎng)好的菌放入超凈臺(tái)，挑取在加紅霉素板上長(zhǎng)而在加卡那霉素板上沒(méi)有長(zhǎng)的菌落，接種到新的板上。同樣是先點(diǎn)種紅霉素板，再點(diǎn)種卡那霉素板，放入30℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36小時(shí)。 配制LB液體培養(yǎng)基，分裝到大試管中，每個(gè)試管5mL。用滅好菌的槍頭挑取在加卡那霉素板上長(zhǎng)而在加紅霉素的板上不長(zhǎng)的菌株，接種到試管中，放入搖床，30℃ 200rpm下培養(yǎng)24h。EP管中加700μL 50%的甘油，再吸取700μL菌懸液加到管中，搖勻。編號(hào)，保存至70℃冰箱?！ ∨渲芁B液體培養(yǎng)基，滅過(guò)小試管，每個(gè)瓶中加入2 mL LB液體培養(yǎng)基，接入20μL保藏的菌株，放入搖床，30℃ 200rpm下培養(yǎng)24h。() 配制LB液體培養(yǎng)基，滅過(guò)三角瓶，每個(gè)瓶中加入100 mL LB液體培養(yǎng)基，接入1mL已活化的菌懸液，放入搖床，30℃ 200rpm下培養(yǎng)24h。 首先測(cè)量每個(gè)菌的OD值，用滅過(guò)菌的LB培養(yǎng)基稀釋調(diào)節(jié)至各個(gè)菌的OD值至相同。配制淀粉固體培養(yǎng)基，倒平板?！ ∨渲频矸酃腆w培養(yǎng)基，倒平板。用槍頭吸取2μL已調(diào)好相同濃度的菌懸液點(diǎn)種到平板上，一個(gè)平板點(diǎn)種7個(gè)菌，每個(gè)菌重復(fù)三次，將點(diǎn)種好的平板放入30℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。將培養(yǎng)好的平板中滴加盧戈氏碘液，染色。并量取不同菌落的透明圈的大小。 為保證目標(biāo)菌株的培養(yǎng)條件相同，將疑似菌株點(diǎn)種到同一個(gè)平板上，將點(diǎn)種好的平板放入30℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。將培養(yǎng)好的平板中滴加盧戈氏碘液，染色。并量取不同菌落的透明圈的大小。 3結(jié)果現(xiàn)象與分析 轉(zhuǎn)座得到100個(gè)突變體，編號(hào)從1至100。0 1100號(hào)菌株培養(yǎng)24h后，對(duì)其進(jìn)行碘液染色。結(jié)果顯示，09和33594號(hào)菌的透明圈出現(xiàn)較大差異（表1圖：1 ）。，菌株335。表1 09菌株與目標(biāo)菌株透明圈直徑菌號(hào) 透明圈直徑大?。╩m） 現(xiàn)象 重復(fù)1 重復(fù)2 重復(fù)3 平均值 09 透明圈直徑大小適中36 透明圈直徑比對(duì)照菌大的多38 透明圈直徑比對(duì)照菌大的多56 透明圈直徑比對(duì)照菌小的多94 透明圈直徑比對(duì)照菌小的多 圖1 33594與09菌株透明圈直徑 胞外淀粉酶產(chǎn)生 臘狀芽孢桿菌09是從一株健康小麥植株中分離獲得的有益芽孢桿菌，為小麥內(nèi)生細(xì)菌，產(chǎn)生的胞外淀粉酶能夠?qū)⑿←滙w內(nèi)的淀粉分解為菌體能更好利用的物質(zhì)（如：麥芽糖）。調(diào)控09菌分泌胞外淀粉酶的基因位于菌體的結(jié)構(gòu)基因中。從實(shí)驗(yàn)的338號(hào)菌來(lái)看，它們的透明圈直徑都遠(yuǎn)大于對(duì)照組09號(hào)菌株的透明圈直徑。調(diào)控分泌胞外淀粉酶的基因遭到破壞之后可能導(dǎo)致產(chǎn)生的淀粉酶的量更大，但從594號(hào)菌來(lái)看，它們透明圈的直徑又小與對(duì)照組09的透明圈直徑。這說(shuō)明基因被插入的位置不同也可能導(dǎo)致胞外淀粉酶的合成能力或者是分泌能力下降，最終導(dǎo)致產(chǎn)生的淀粉酶的量較對(duì)照組小?！ ∫虼耍诩?xì)菌分泌胞外淀粉酶的量和多個(gè)因素有關(guān)。最主要的是芽孢桿菌內(nèi)部的基因調(diào)控。淀粉酶基因本身的表達(dá)能力受到多個(gè)基因的調(diào)控，基因內(nèi)部的調(diào)控基因、啟動(dòng)子受到破壞或者是被外源基因插入后都會(huì)導(dǎo)致淀粉酶產(chǎn)生的多少受到影響。芽孢桿菌膜系統(tǒng)的分泌能力和淀粉酶的運(yùn)輸能力都與最終檢測(cè)到
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