蛋白質(zhì)組研究技術(shù)ppt課件(編輯修改稿)
2025-05-30 06:01 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 10 109 1011 100 108 1010 1000 107 109 10 000 106 108 100 000 105 107 以 6 107個細(xì)胞得到 1mg可溶酵母蛋白計算。 2. 2 膜蛋白 ? 膜蛋白是一些 疏水性 的蛋白質(zhì)，在常規(guī) 2DE的提取液中的 溶解度低 ，另外因聚焦而產(chǎn)生 濃縮、聚集 ，從而使得膜蛋白很 難融解并進(jìn)入二向 SDSPAGE電泳 ，因此很難被檢測到 樣品預(yù)分離 （ prefractionation) 分步提取法 （ sequential extraction） ? 原理：蛋白質(zhì)的溶解度差異 ? 采用 3種不同的提取液 進(jìn)行 分步提取 和 分別電泳 ；實(shí)際上是增加了 融解性能 不同的 第三維分離 多間隔電離法（ multipartment electrolyser） ? 實(shí)質(zhì)上是一種制備等電聚焦的方法。 ? 電泳裝置由中間的聚焦室和兩端的電極室組成。聚焦室由隔膜分成多個樣品室。電極室內(nèi)裝電極，由陰陽離子交換膜將電解質(zhì)與樣品分開。操作時，將預(yù)分離的蛋白質(zhì)混合物放進(jìn)聚焦室中，隨著等電聚焦電泳的進(jìn)行，混合物中的蛋白質(zhì)根據(jù)各自的等電點(diǎn)不同而聚焦到相應(yīng)的樣品室中并被分別收集 多間隔電離法示意圖 很難被分開： 商業(yè)化的 IPG膠條的 pH范圍通常在 310，等電點(diǎn)超過 10的蛋白質(zhì)很難被分開。目前已經(jīng)有 pH范圍到 12的 IPG膠條 ，從而得到了部分的解決 大部分的細(xì)胞提取物是酸性蛋白質(zhì) ：去除酸性蛋白質(zhì)改善堿性蛋白質(zhì)的分離與檢測。可以采用剛才介紹的方法，制備等電聚焦預(yù)分離，將堿性蛋白質(zhì)富集，再采用堿性 pH梯度膠進(jìn)行分離 4. IPG膠條的改進(jìn) 膠條的 pH范圍在不斷變窄 ：改善了 2DE的分辨率，增加了上樣量，從而提高了蛋白質(zhì)的檢出，而且可以針對不同樣品選擇不同的膠條 膠條的 pH范圍也在不斷擴(kuò)大 ：改善了堿性蛋白質(zhì)的分離 不同長 度的膠條 ：通常采用的是 18cm的膠條，可以達(dá)到 2022種以上蛋白質(zhì)點(diǎn)的分辨率； 24cm、40cm 蛋白質(zhì)組研究的高通量需要研究體系的自動化：集中在 2DE后的樣品處理和蛋白質(zhì)的識別 自動點(diǎn)切割儀，自動樣品處理機(jī)等：減少了手工操作，縮短了時間，提高了效率； 提高了樣品處理的重復(fù)性 ，避免了手工操作易產(chǎn)生的污染 可同時運(yùn)行 12塊膠的二向 SDSPAGE電泳槽已經(jīng)研制成功并商品化 2DE，染色，圖像分析 自動 MS樣品分析 自動蛋白酶解，多肽回收，點(diǎn)樣于 MS樣品靶 自動采集數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)庫檢索，蛋白鑒定 膠上蛋白點(diǎn)自動切割，置于 96或 384孔板 蛋白質(zhì)識別過程的自動化流程 分子掃描（ molecular scanner）： 將一個固相化了胰蛋白酶的 PVDF膜插入 2DE電泳膠和另一個PVDF膜之間，后一個 PVDF膜作為收集膜。當(dāng)對上述體系進(jìn)行電轉(zhuǎn)印時，膠上的蛋白質(zhì)在向第一個PVDF膜遷移的過程中被胰蛋白酶酶切，酶切肽段穿過帶有固相化胰酶的 PVDF膜，被第二個 PVDF膜收集。收集膜可直接用于 MALDITOFMS做肽質(zhì)量指紋譜分析。 ? 實(shí)現(xiàn)了 2DE后的樣品處理與質(zhì)譜分析一體化； 肽段數(shù)目低，使蛋白質(zhì)特別是翻譯后修飾蛋白質(zhì)的識別與鑒定效率受到影響。 6. 2DE的局限性 ? 實(shí)驗(yàn)設(shè)計：樣本間的異質(zhì)性以及組織中多種細(xì)胞的并存，將影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。 激光捕獲顯微切割的方法（ lasercapture microdissection, LCM）：單一細(xì)胞 ? 重復(fù)性：是 2DE方法存在的主要問題 ? 動態(tài)范圍：有限的動態(tài)范圍與低拷貝蛋白質(zhì)的難以檢測也是 2DE目前尚未完全解決的問題。 放射性同位素標(biāo)記 激光
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1