《蛋白質(zhì)組研究技術》ppt課件-預覽頁
【正文】 位素編碼親和標簽技術（ isotopecoded affinity tags, ICAT）和雙色熒光技術等 ? 蛋白質(zhì)相互作用：酵母雙雜交技術、蛋白質(zhì)復合物免疫分離與質(zhì)譜鑒定技術； ? 蛋白質(zhì)分離于鑒定：多維色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術 ? 翻譯后修飾：蛋白質(zhì)圖譜展示與檢測技術 ? 蛋白質(zhì)表達：蛋白質(zhì)芯片技術 第二節(jié) 大規(guī)模的蛋白質(zhì)分離技術 ? 蛋白質(zhì)組學的目的 ：實現(xiàn)對一個基因組所編碼的全部蛋白質(zhì)及其相互作用的研究 ? 首要問題：蛋白質(zhì)的有效分離 ? 理想的蛋白質(zhì)分離方法： 超高分辨率 ； 可針對不同類型的蛋白質(zhì) 一、二維凝膠電泳 1. 2DE的介紹： 是目前唯一能夠?qū)?shù)千種蛋白同時分離與展示的技術 在 2DE中，蛋白質(zhì)首先根據(jù)等電點的不同，在一向等電聚焦電泳中分離，接著被轉(zhuǎn)移到二向 SDS聚丙稀酰胺凝膠上，再根據(jù)相對分子質(zhì)量大小不同被分離 固相化 pH梯度（ immobilized pH gradient, IPG）等電聚焦電泳技術；微量鑒定技術以及質(zhì)譜技術靈敏度的提高 不足：膜蛋白、堿性蛋白、低豐度蛋白的分離與檢測；重復性以及規(guī)?；妥詣踊膯栴}等 改進： 2DE樣品的前處理； 2DE后的蛋白點的檢測研究等 ? 第一向進行等電聚焦（ isoelectric focusing ,IEF） ,由于蛋白質(zhì)具有兩性解離和等電點特性，將蛋白質(zhì)樣品加載至pH梯度介質(zhì)上進行電泳時，會向與其所帶電荷相反的電極方向移動。目前常使用預制膠條（ IPG）用于蛋白質(zhì)的等電聚焦分離，將聚焦好的 IPG膠條在含有 SDS的緩沖液中平衡 ? 第二向是將在 IPG膠條中經(jīng)過第一向分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到SDSPAGE凝膠上，根據(jù)蛋白質(zhì)的相對質(zhì)量或分子量大小與第一向相垂直的分離。 ? 一步法（ oneextractonegel）：一步提取的細胞總蛋白在一塊膠上進行電泳分離；高豐度蛋白 ? 加大上樣量， 但有限制 ? 窄范圍的 IPG膠條 （ 23個 pH單位）、 非常窄范圍的 IPG膠條 （約 1個 pH單位）：可以增加電泳膠的 分辨率 ，加大樣品的 負載量，但存在超出 pH范圍的蛋白 ? 去除高豐度的蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)的檢出限預染色方法、起始加樣量的關系 銀染（ 1ng） 考馬斯亮藍染（ 100ng） 蛋白質(zhì)的豐度 拷貝數(shù) /細胞 蛋白質(zhì)的量 mg 細胞數(shù) 蛋白質(zhì)的量 mg 細胞數(shù) 10 109 1011 100 108 1010 1000 107 109 10 000 106 108 100 000 105 107 以 6 107個細胞得到 1mg可溶酵母蛋白計算。電極室內(nèi)裝電極，由陰陽離子交換膜將電解質(zhì)與樣品分開。當對上述體系進行電轉(zhuǎn)印時，膠上的蛋白質(zhì)在向第一個PVDF膜遷移的過程中被胰蛋白酶酶切，酶切肽段穿過帶有固相化胰酶的 PVDF膜，被第二個 PVDF膜收集。 激光捕獲顯微切割的方法（ lasercapture microdissection, LCM）：單一細胞 ? 重復性：是 2DE方法存在的主要問題 ? 動態(tài)范圍：有限的動態(tài)范圍與低拷貝蛋白質(zhì)的難以檢測也是 2DE目前尚未完全解決的問題。 ? 已經(jīng)成功用于 2DE膠上蛋白質(zhì)的鑒定 2. MALDITOFTOF質(zhì)譜儀 ? 該儀器將 MALDITOF肽質(zhì)量指紋譜分析的高通量與碰撞誘導解離（ collisioninduced dissociation, CID）獲得的豐富碎片信息相結(jié)合，對同一樣品相進行肽質(zhì)量指紋譜分析，接著進行串連質(zhì)譜分析， 使得在微量樣品水平上對蛋白質(zhì)的鑒定在數(shù)秒內(nèi)完成 四、結(jié)語 蛋白質(zhì)組學的研究開辟了功能基因組學研究的新領
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