【正文】 記 蛋白酶切 親和色譜分離（只有被同位素標記的肽段能被色譜柱保留） 進入質譜進行鑒定 ?通過比較標記重鏈和輕鏈試劑肽段在質譜圖中信號的強度， 可以實現(xiàn)對差異表達蛋白質的定量分析 ，采用串連質譜技術測定肽段的序列，可以實現(xiàn)蛋白質的 定性鑒定 ICAT－親和色譜－質譜技術流程圖 ? 優(yōu)勢： 可以實現(xiàn)對不同條件處理的細胞差異蛋白質的定量分析，而且大大簡化了被分離樣品的復雜程度 ? 不足： 無法分析和鑒定不含半胱氨酸的蛋白質；試劑的高價位 三、一維電泳（色譜）－質譜技術 SDSPAGE電泳（色譜）－質譜分離鑒定蛋白質復合物 ? 蛋白質復合物的 分離與鑒定 是功能蛋白質組研究的核心內容 ? SDSPAGE電泳結合 MALDITOFMS技術，或者蛋白酶切結合 LCMSMS技術直接分離和鑒定蛋白質復合物被證明是一種有效的方法 蛋白質復合物一維電泳（色譜）－質譜分析流程圖 蛋白質復合物的分離 肽段混合物（溶液中） 蛋白質混合物溶液 SDSPAGE MALDITOFMS 肽段混合物（膠上） 蛋白酶切 LCMSMS 蛋白質復合物鑒定 數(shù)據(jù)庫檢索 蛋白質復合物電泳（色譜）－質譜分析流程圖 2. 一維 IEF電泳－質譜分離鑒定蛋白質 ? 與質譜方法相比， SDSPAGE測定蛋白質相對分子 質量誤差大，分辨率差， 更重要的是， 很難獲得翻譯后修飾蛋白質相對分子質量變化的準確信息 ? 精確測定全細胞蛋白質的相對分子質量 ? 一維 IEF電泳－質譜： 采用 IPG膠條進行等電聚焦電泳， MALDITOFMS對膠條 進行表面直接分析 。 ? 實現(xiàn)了 2DE后的樣品處理與質譜分析一體化； 肽段數(shù)目低，使蛋白質特別是翻譯后修飾蛋白質的識別與鑒定效率受到影響。當?shù)鞍走w移至其等電點 pH位置時，其凈電荷數(shù)為零，在電場中不再移動。 ? 酵母中 2500個編碼基因的 CBI小于 。將一向 IEF電泳與準確、靈敏、高分辨率的相對分子質量測定技術相結合，誤差 ％ ％ 第三節(jié) 高通量蛋白質鑒定技術 一、生物質譜技術 1. 質譜技術：一百多年的歷程，早期的質譜技術分析對象主要是小分子化合物，質量范圍在幾千以下 2. 20世紀 80年代末期，產生了兩項軟電離質譜技術－ ESI和 MALDITOF，具有高靈敏度（ pmol）和高質量檢測范圍（幾萬到幾十萬 Da） 3. ESI ：采用四級桿質量飛行器，所構成的儀器成為電噴霧（四級桿）質譜儀；其特點之一是可以和液相色譜、毛細管電泳等高效分離手段聯(lián)用，因而可以實現(xiàn) 復雜化合物分離與鑒定的聯(lián)機操作 4. MALDITOF ： 常用飛行時間質量分析器，所構成的儀器成為基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀； 特點是對鹽和填加物的耐受能力強，且操作簡單，測定速度快，易于實現(xiàn)高通量，譜峰與樣品成分的質量有一一對應關系，圖譜容易解析 5. 離子阱 （ ion trap） 質譜儀和傅立葉變換離子回旋共振 （ fourier transform ion cyclotron resonance, FTICR）質譜 6. 電噴霧－四極桿－飛行時間質譜儀 ： 大大提高了儀器的分辨率和靈敏度 7. 帶有串連質譜功能的 MALDITOF質譜儀 ：引進了源后裂解或碰撞誘導解離裝置， 可進行肽序列測定 二、 2DE膠上蛋白質識別與鑒定技術 2DE電泳 已知蛋白 蛋白質膠上原位酶切 MALDITOFMS分析 肽質量指紋譜數(shù)據(jù)庫檢索 蛋白質鑒定 ESIMSMS分析 蛋白質鑒定 肽序列標簽數(shù)據(jù)庫檢索 蛋白質從頭測序 新蛋白 已知蛋白 易于實現(xiàn)高通量 特異性高，可實現(xiàn)分離、 鑒定一體化操作 2DE膠