蛋白質(zhì)組研究技術(shù)ppt課件-wenkub.com
2025-04-30 06:01 本頁面
【正文】 隨著基因組學(xué)與生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，政府投資與商業(yè)投入的加大，蛋白質(zhì)組學(xué)研究必將在 21世紀(jì)取得突破性的進(jìn)展。 ? 樣本蛋白質(zhì)混合物 蛋白酶裂解 二維色譜分離 質(zhì)譜分析鑒定蛋白質(zhì) 色譜反相柱 質(zhì)譜儀 串連質(zhì)譜測序 數(shù)據(jù)庫檢索匹配 蛋白質(zhì)鑒定 蛋白質(zhì)混合物二維色譜 /質(zhì)譜分析流程 樣品 ? 優(yōu)勢： 識別和鑒定低豐度蛋白、膜蛋白、酸性蛋白、堿性蛋白以及相對分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì) ? 不足： 通過蛋白質(zhì)直接酶切得到的肽段混合物過于復(fù)雜，較難實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞全部蛋白質(zhì)的識別與鑒定 2. 同位素標(biāo)記（ ICAT） 親和色譜 質(zhì)譜技術(shù) ? ICAT， isotopecoded affinity tagging：不但可以實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞差異表達(dá)蛋白質(zhì)的定量分析，而且可以大大簡化被分析樣品的復(fù)雜性 ? ICAT方法的關(guān)鍵是 ICAT試劑的應(yīng)用： 半胱氨酸 生物素標(biāo)簽 連接部分 （重鏈或輕鏈） 巰基特異反應(yīng)基團(tuán) ICAT試劑示意圖 ?方法：蛋白質(zhì)進(jìn)行 ICAT試劑標(biāo)記 蛋白酶切 親和色譜分離（只有被同位素標(biāo)記的肽段能被色譜柱保留） 進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行鑒定 ?通過比較標(biāo)記重鏈和輕鏈試劑肽段在質(zhì)譜圖中信號的強(qiáng)度， 可以實(shí)現(xiàn)對差異表達(dá)蛋白質(zhì)的定量分析 ，采用串連質(zhì)譜技術(shù)測定肽段的序列，可以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的 定性鑒定 ICAT－親和色譜－質(zhì)譜技術(shù)流程圖 ? 優(yōu)勢： 可以實(shí)現(xiàn)對不同條件處理的細(xì)胞差異蛋白質(zhì)的定量分析，而且大大簡化了被分離樣品的復(fù)雜程度 ? 不足： 無法分析和鑒定不含半胱氨酸的蛋白質(zhì)；試劑的高價位 三、一維電泳（色譜）－質(zhì)譜技術(shù) SDSPAGE電泳（色譜）－質(zhì)譜分離鑒定蛋白質(zhì)復(fù)合物 ? 蛋白質(zhì)復(fù)合物的 分離與鑒定 是功能蛋白質(zhì)組研究的核心內(nèi)容 ? SDSPAGE電泳結(jié)合 MALDITOFMS技術(shù)，或者蛋白酶切結(jié)合 LCMSMS技術(shù)直接分離和鑒定蛋白質(zhì)復(fù)合物被證明是一種有效的方法 蛋白質(zhì)復(fù)合物一維電泳（色譜）－質(zhì)譜分析流程圖 蛋白質(zhì)復(fù)合物的分離 肽段混合物（溶液中） 蛋白質(zhì)混合物溶液 SDSPAGE MALDITOFMS 肽段混合物（膠上） 蛋白酶切 LCMSMS 蛋白質(zhì)復(fù)合物鑒定 數(shù)據(jù)庫檢索 蛋白質(zhì)復(fù)合物電泳（色譜）－質(zhì)譜分析流程圖 2. 一維 IEF電泳－質(zhì)譜分離鑒定蛋白質(zhì) ? 與質(zhì)譜方法相比， SDSPAGE測定蛋白質(zhì)相對分子 質(zhì)量誤差大，分辨率差， 更重要的是， 很難獲得翻譯后修飾蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量變化的準(zhǔn)確信息 ? 精確測定全細(xì)胞蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量 ? 一維 IEF電泳－質(zhì)譜： 采用 IPG膠條進(jìn)行等電聚焦電泳， MALDITOFMS對膠條 進(jìn)行表面直接分析 。 ? 實(shí)現(xiàn)了 2DE后的樣品處理與質(zhì)譜分析一體化； 肽段數(shù)目低，使蛋白質(zhì)特別是翻譯后修飾蛋白質(zhì)的識別與鑒定效率受到影響。目前已經(jīng)有 pH范圍到 12的 IPG膠條 ，從而得到了部分的解決 大部分的細(xì)胞提取物是酸性蛋白質(zhì) ：去除酸性蛋白質(zhì)改善堿性蛋白質(zhì)的分離與檢測。 ? 電泳裝置由中間的聚焦室和兩端的電極室組成。 ? 密碼子偏性系數(shù)（ codon bias index） : CBI小于 。當(dāng)?shù)鞍走w移至其等電點(diǎn) pH位置時，其凈電荷數(shù)為零，在電場中不再移動。高密度陣列檢測專用的掃描儀已經(jīng)出現(xiàn) 非特異 蛋白質(zhì)可以用非特異的方法如蛋白染色或較特異的方法如抗體進(jìn)行檢測 分子的穩(wěn)定性 DNA是 非常穩(wěn)定 的，即使在提高溫度的情況下也不丟失生物活性 蛋白質(zhì)在 變性情況下將喪失天然功能 ，需要格外小心保持其天然構(gòu)象 重復(fù)性 重復(fù)性好 將 DNA固相化在表面已經(jīng)是成熟的技術(shù)，加之 DNA固有的穩(wěn)定性，方法的重復(fù)性較好
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