【正文】 激光捕獲顯微切割的方法（ lasercapture microdissection, LCM）：單一細胞 ? 重復性：是 2DE方法存在的主要問題 ? 動態(tài)范圍：有限的動態(tài)范圍與低拷貝蛋白質(zhì)的難以檢測也是 2DE目前尚未完全解決的問題。目前常使用預制膠條（ IPG）用于蛋白質(zhì)的等電聚焦分離，將聚焦好的 IPG膠條在含有 SDS的緩沖液中平衡 ? 第二向是將在 IPG膠條中經(jīng)過第一向分離的蛋白質(zhì)轉移到SDSPAGE凝膠上，根據(jù)蛋白質(zhì)的相對質(zhì)量或分子量大小與第一向相垂直的分離。樣品經(jīng)過電荷和質(zhì)量兩次分離后，得到等電點和分子量的信息 、膜蛋白的檢測與樣品預分離 低豐度蛋白 ? 大部分的蛋白質(zhì)是低豐度的蛋白質(zhì)，而低豐度的蛋白質(zhì)往往是執(zhí)行重要生物功能的蛋白質(zhì) ? 密碼子偏性（ codon bias） :指生物體中編碼同一種氨基酸的同義密碼子的非均衡使用現(xiàn)象。 放射性同位素標記 激光捕獲顯微切割示意圖 ? 蛋白質(zhì)的丟失：疏水性蛋白質(zhì)、分子質(zhì)量大于 100kDa的蛋白質(zhì) ? 通量和自動化：圖像分析仍然是瓶頸 二、色譜－質(zhì)譜技術 －串連質(zhì)譜技術（ 2DHPLCMSMS） 二維色譜分離蛋白質(zhì)和多肽 優(yōu)點 缺點 2DE 高分辨率， 1000個蛋白質(zhì) 可得到等電點、相當分子質(zhì)量信息 可得到蛋白質(zhì)表達譜 可平行運行多個膠 費時、費力；不易自動化 疏水、酸性、堿性、 10k Da、 200kDa 蛋白易丟失 樣品負載量受限制 2DHPLC 快速 可分離各種蛋白質(zhì) 易于自動化 樣品在液相；餾分易收集 可做樣品制備或濃縮 不能得到等電點、相對分子質(zhì)量信息 尚未實現(xiàn)平行操作 不易得到蛋白質(zhì)表達譜 分辨率不夠高 2DE與 2DHPLC的比較 ? 二維色譜分離蛋白質(zhì)的優(yōu)勢： 快速；可分離各種蛋白質(zhì)；樣品在液相，餾分易收集；易于自動化；可做樣品制備或濃縮 ? 二維色譜分離蛋白質(zhì)有多種組合模式： 第一維色譜一般是離子交換色譜 /凝膠過濾色譜，第二維通常是反相色譜 scx陽離子交換柱 2DHPLC分離體系示意圖 緩沖液 廢液 樣品 反相柱 檢測器 洗液－流動相 反相柱1 反相柱2 流動相 廢液 10通道切換閥 二維色譜－串連質(zhì)譜分離鑒定細胞蛋白質(zhì) ? 采用二維色譜－串連質(zhì)譜技術可以 對蛋白質(zhì)混合物進行直接分離與鑒定 。 6. 2DE的局限性 ? 實驗設計：樣本間的異質(zhì)性以及組織中多種細胞的并存，將影響實驗結果的可靠性。根據(jù)各自不同的等電點，蛋白質(zhì)最終被聚焦在一個很窄的 pH梯度介質(zhì)區(qū)域內(nèi)。 ? 密碼子偏性系數(shù)（ codon bias index） : CBI小于 。 ? 樣本蛋白質(zhì)混合物 蛋白酶裂解 二維色譜分離 質(zhì)譜分析鑒定蛋白質(zhì) 色譜反相柱 質(zhì)譜儀 串連質(zhì)譜測序 數(shù)據(jù)庫檢索匹配 蛋白質(zhì)鑒定 蛋白質(zhì)混合物二維色譜 /質(zhì)譜分析流程 樣品 ? 優(yōu)勢： 識別和鑒定低豐度蛋白、膜蛋白、酸性蛋白、堿性蛋白以及相對分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì) ? 不足： 通過蛋白質(zhì)直接酶切得到的肽段混合物過于復雜，較難實現(xiàn)對細胞全部蛋白質(zhì)的識別與鑒定 2. 同位素標記（ ICAT） 親和色譜 質(zhì)譜技術 ? ICAT， isotopecoded affinity tagging：不但可以實現(xiàn)對細胞差異表達蛋白質(zhì)的定量分析，而且可以大大簡化被分析樣品的復雜性 ? ICAT方法的關鍵是 ICAT試劑的應用： 半胱氨酸 生物素標簽 連接部分 （重鏈或輕鏈） 巰基特異反應基團 ICAT試劑示意圖 ?方法：蛋白質(zhì)進行 ICAT試劑標