【文章內(nèi)容簡介】 如果運(yùn)氣好的話 ， 晶體會(huì)逐漸從過飽和溶液中析出并且不需要其他步驟 。 蛋白質(zhì)的結(jié)晶 ? 透析法（ dialysis） 適用于 對(duì)于大量蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行結(jié)晶。 ? 微量透析法（ liquidliquid diffusion ） ? 圖 a和圖 b中 ， 蛋白質(zhì)溶液保留在毛細(xì)管中 。 圖 c中 ， 蛋白質(zhì)溶液被甩到管底并與膜接觸 。 圖 d和圖 e中 ， 毛細(xì)管置于盛有滲析液的 Eppendorf管中 。 蛋白質(zhì)的結(jié)晶 ? 液液擴(kuò)散法 熔點(diǎn)毛細(xì)管中的液液擴(kuò)散 圖示為沉淀劑密度較大時(shí) —— 這種方法是在小孔毛細(xì)管中將蛋白質(zhì)溶液與含有沉淀劑的溶液相互覆蓋 ，讓其自己緩慢擴(kuò)散的過程。 —— 蛋白質(zhì)溶液與沉淀劑以 1:1混合。因此沉淀劑濃度 應(yīng)為最終所需濃度的 2倍。 蛋白質(zhì)的結(jié)晶 氣相擴(kuò)散法 ? 懸滴法 ? 使用帶有空穴的盤子 ， 蛋白質(zhì)溶液的液滴懸掛在蓋玻片的下方 ， 蓋玻片覆蓋在密封有沉淀劑溶液的空穴上方 。蓋玻片的表面經(jīng)過硅化處理以阻止液滴在玻璃表面的鋪展 。 ? 這種方法是利用氣相平衡的原理，使任何揮發(fā)性的組分在小液滴和大樣品池間達(dá)到平衡，使蛋白質(zhì)液滴中沉淀劑及蛋白質(zhì)的濃度逐漸增加 ， 達(dá)到過飽和狀態(tài)，最終析出晶體 ? 非常適用于只有少量樣品，卻要篩選大量條件的情況。 蛋白質(zhì)的結(jié)晶 ? 坐滴法 ? 如果蛋白質(zhì)溶液表面張力低 ， 在懸滴法中蛋白質(zhì)溶液在蓋玻片上鋪展而不能形成液滴 ， 此時(shí)可用坐滴法 。 蛋白質(zhì)的結(jié)晶 蛋白質(zhì)結(jié)晶條件 ? 雜質(zhì)、晶核及其他因素如溫度、溶液 PH值 及振動(dòng)等都會(huì)影響結(jié)晶過程。 ? 為使蛋白質(zhì)結(jié)晶，要求： ? 蛋白質(zhì)純度足夠高，不含其他化合物。 ? 蛋白質(zhì)分子表面性質(zhì)相同，聚集形式均一。 ? 蛋白質(zhì)溶解在合適的溶劑中。 ? 溶液達(dá)到過飽和，使蛋白質(zhì)形成小的聚集體，作為晶體生長的晶核。晶核形成，晶體才開始生長。 ? 溶液的過飽和度要降至最低水平，避免太多的晶核產(chǎn)生。 ? 晶體生長盡量緩慢以便在結(jié)構(gòu)中達(dá)到最大的有序度，方法：改變溫度，蛋白質(zhì)濃度等。 蛋白質(zhì)的結(jié)晶 Protein Sample Protein Concentration: 520mg/ml Salt concentration: as low as possible. If the protein is not soluble, change the pH of the buffer or add small amounts of different salts. Buffer concentration: 510mM, 1020 times lower than the buffer concentration used in the well. (100mM in the first screen). Stabilizer:DTT, EDTA and protease inhibitors. A typical protein buffer is 10mM TEA/HCl, , 25mM NaCl, 1mM DTT, 1mM EDTA and 1mM NaN3. 蛋白質(zhì)的結(jié)晶 Precipitants used in macromolecular crystallization 1. Salts: (NH4)2SO4 2. Volatile anic solvents: Ethanol 3. Long chain polymers: PEG4000 4. Low molecular weight polymers and nonvolatile anic pounds: MPD Table 3. Precipitants used in macromolecular crystallization Factors affecting crystallization 1. For macromolecule: purity, stability, modification, etc。 2. Some chemical factors: pH, precipitant, ion strength, specific ions, etc。 3. Some physical factors: temperature, crystallization method, time, etc. 1. Homogeity: purity is very important。 2. Solubility: dissolve protein to high concentration。 3. Stability: maintain protein as stable as possible。 4. Supersaturation: alter the properties of solution for supersaturation。 5. Association: try to promote ordered association。 6. Nucleation: try to promote the formation of nuclei。 7. Variety: try as many methods as possible。 8. Liquid impurities: avoid impurities in the mother liquid。 9. Preservation: protect plate and crystal from shock and disruption。 Conclusions: some important principles Screening Robotic Manual ? Cheap ? Readily available ? Allows for creativity ? Multitude of conditions ? Highly reproducible ? Easy to document and track data ? Lower consumption of protein 結(jié) 晶 蛋白質(zhì)的結(jié)晶 CrystalMation 蛋白質(zhì)的結(jié)晶 X光光源及探測器 ? 收集 X光衍射數(shù)據(jù)的主要硬件設(shè)備： ?X光光源 ?單色器 ?X光探測器 X光光源 ? 密封 X射線管（ sealed xray tubes） ? 旋轉(zhuǎn)陽極管 （ rotating anode tubes） ? 同步輻射 ( Synchrotron Radiation) X光光源 —— 密封 X射線管 ? 在密封 X射線管中，陰極發(fā)射電子，因?yàn)楣茏犹幱谡婵諣顟B(tài)，相對(duì)于金屬陽極，陰極有很高的負(fù)電勢(shì)，電子被加速并以很高的速度到達(dá)陽極。陽極通常是銅板。 ? 電子能量的大部份轉(zhuǎn)變成熱量。一小部分能量以兩種不同的 X射線的形式發(fā)出來。 密封 X射線管 —— X射線產(chǎn)生原理 ? 銅陽極靶的 X射線管的光譜。 ? 平滑的連續(xù)區(qū)域是減速（或加速）的帶電粒子發(fā)出的電磁輻射造成的。 ? 銳鋒則是由于電子在陽極物質(zhì)的原子的內(nèi)部軌道中發(fā)生躍遷時(shí)產(chǎn)生的高能電子轟擊陽極原子，原子的低能級(jí)電子被轟擊出來，而高能級(jí)電子占據(jù)空軌道，在這一過程中便釋放出特定波長的 X射線。 ? 由于 L－ 層的精細(xì)結(jié)構(gòu)， Kα分裂為 Kα1和 Kα2兩條譜線。 M層的能級(jí)很靠近，因此 Kβ只是一個(gè)單峰。 ? 為了得到光譜中特定波長的譜線，需要一個(gè)最小激發(fā)電壓 。 ? 加大電壓或者增大管電流可以增加衍射的強(qiáng)度。 ? 局限性：在聚焦點(diǎn)處電子束對(duì)陽極所產(chǎn)生的致熱作用限制了 X射線管的最大功率。功率太大將毀壞射線管。 X光光源 —— 旋轉(zhuǎn)陽極管 ? 與 密封 X射線管類似 ， 只是用可旋轉(zhuǎn)的柱體代替固定的金屬片 。 ? 比密封管的優(yōu)點(diǎn)是它較高的輻射強(qiáng)度 ，伴隨的缺點(diǎn)是必須連續(xù)的抽氣以保持其所需的真空度 。 X光光源 —— 同步輻射 ? 藝術(shù)家畫的座落于 格勒諾布爾 [法國東南部城市 ]Grenoble的歐洲同步輻射裝置。 ? 周長是 。 ? 同步輻射器是一個(gè)龐大而且昂貴的裝置。環(huán)的直徑有 10到幾百米的大小。 X光光源 —— 同步輻射（原理） ? 同步輻射儀是以同步加速器為基礎(chǔ)構(gòu)建而成。 ? 同步加速器是使帶電粒子（負(fù)電子或正電子）以近光速回轉(zhuǎn)的裝置。粒子從線性加速器或輔助同步輻射裝置直接注入儲(chǔ)存環(huán)。 ? 粒子在電場和磁場共同作用下運(yùn)動(dòng)。其的軌跡由它們的能量及使帶電粒子改變方向的磁場決定。 ? 當(dāng)粒子束改變方向時(shí)，負(fù)電子或正電子便向環(huán)中心方向加速，釋放出 電磁輻射 ，進(jìn)而釋放能量。能量的損失由每次循環(huán)的射頻輸入來補(bǔ)償。 ? 由于自由運(yùn)動(dòng)的電子 (和正電子 ) 是無法量子化的 ， 依賴帶電粒子的能量和磁場強(qiáng)度的不同 ， 所產(chǎn)生的輻射的范圍很廣 。 同步輻射的特性 ? 高強(qiáng)度 (intensity) 僅用彎曲磁場它就能產(chǎn)生比普通 X射線發(fā)生器高兩個(gè)數(shù)量級(jí)的輻射 ， 而用多極搖擺磁場或波紋磁場能產(chǎn)生更高數(shù)量級(jí)的輻射 。 非常適用于衍射能力弱的樣品的數(shù)據(jù)收集 。 另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是射線的低發(fā)散度 ， 這導(dǎo)致清晰的衍射點(diǎn) 。