蛋白質(zhì)組學(xué)修ppt課件(編輯修改稿)
2025-02-11 09:39 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 ? 細(xì)胞樣品：反復(fù)凍融、超聲破碎 ? 組織樣品：碾磨、勻漿 ? 植物樣品：碾磨 ? 分泌蛋白 蛋白質(zhì)樣品的濃縮、去除濾液中的高豐度蛋白 ? 菌體蛋白 裂解液處理、超聲破碎 雙向電泳樣品的溶解 ? 是成功進(jìn)行雙向電泳的最關(guān)鍵因素之一 ? 溶解的目標(biāo)： ? 樣品中非共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和聚積體完全破壞，從而形成各個(gè)多肽的溶解液； ? 必須將可能干擾 2DE分離的鹽、脂類(lèi)、多糖和核酸等物質(zhì)的去除； ? 保證樣品在電泳過(guò)程中保持溶解狀態(tài)。 增加樣品溶解性的手段 離液劑： 通過(guò)改變?nèi)芤褐械臍滏I結(jié)構(gòu)使蛋白質(zhì)充分伸展，將其疏水中心完全暴露，降低接近疏水殘基的能量域。典型代表是尿素和硫尿。 去垢劑： 經(jīng)過(guò)離液劑處理而暴露蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)后，還常需至少一種去垢劑來(lái)溶解疏水基團(tuán)。常用的去垢劑有離子去污劑 SDS、非離子去污劑 Triton X100和 NP兩性離子去垢劑 CHAPS、OBG等。其中 CHAPS應(yīng)用最普遍。 還原劑： 在離液劑和去垢劑聯(lián)用條件下，加用還原劑可使已變性的蛋白質(zhì)展開(kāi)更完全，溶解更徹底。常用含自由巰基的 DTT或 ?巰基乙醇，以及不帶電荷的三丁基膦（ TBP）進(jìn)行還原。 兩性載體電解質(zhì)： 即便在離液劑和去垢劑存在的情況下，某些蛋白質(zhì)也需要在鹽離子的作用下才能保持其處于溶解狀態(tài)，否則這些蛋白質(zhì)在其處于 PI點(diǎn)時(shí)會(huì)發(fā)生沉淀 兩性載體電解質(zhì)的作用在于補(bǔ)充樣品中少量的鹽分，從而保證蛋白質(zhì)的溶解性。應(yīng)用時(shí)，兩性電解質(zhì)的濃度應(yīng)小于 ％（ w/v)。濃度過(guò)高會(huì)使 IEF的升壓困難、速度降低。 樣品中核酸的去除 ? 對(duì)電泳的影響：增加樣品粘度、與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物后會(huì)出現(xiàn)假象遷移和條紋。 ? 解決方法： ? 用適量純的不含蛋白酶的核酸內(nèi)切酶進(jìn)行降解，或是利用合成載體兩性電解質(zhì)（ SCA）同核酸結(jié)合形成復(fù)合物的能力，再通過(guò)超速離心來(lái)去除復(fù)合物。 ? ReadyPrep 2D cleanup kit 二、適用于質(zhì)譜的染色方法 ? 考馬斯亮蘭（ Coomassie stain） ? 銀染（ Silver Stain ） ? 熒光染色（ SYPRO Ruby protein gel stain） 考馬斯亮藍(lán)染色 ? 考馬斯亮藍(lán)檢測(cè)范圍 30100ng，靈敏度較低，但染色過(guò)程簡(jiǎn)單，所需試劑少，操作簡(jiǎn)便，無(wú)毒性，染色后背景及對(duì)比度好，與下游質(zhì)譜兼容，線性程度好。 ? 膠體考馬斯亮藍(lán)染色的檢測(cè)靈敏度為 810ng，但染色時(shí)間較長(zhǎng)（ 2448小時(shí)），染色過(guò)程給下游質(zhì)譜檢測(cè)帶來(lái)較多不便。 ? BioSafe染料是一種改良的膠體金染色方法。安全無(wú)污染，染色非?？欤?2小時(shí)），完全與下游質(zhì)譜兼容。 銀染 ? 銀染的檢測(cè)靈敏度很高，可達(dá)到 200pg，但其線性很差。普通的銀染過(guò)程中因醛類(lèi)的特異反應(yīng)，而與下游質(zhì)譜不兼容。 ? 快速銀染法，可與下游質(zhì)譜兼容，但其檢測(cè)靈敏度較低，并伴有很深的背景干擾。 熒光染料 ? SYPRO Ruby染料 ? 靈敏度 210ng， 靈敏度與銀染相仿 ， 不對(duì)核酸染色 ? 染色所需時(shí)間較短 ? 染色的動(dòng)態(tài)線性范圍大大優(yōu)于膠體金染色 ， 擴(kuò)展了約 1000倍 。 ? 熒光試劑顯色對(duì)蛋白質(zhì)無(wú)固定作用 ， 不干擾質(zhì)譜或免疫檢測(cè)過(guò)程 ? Cy3和 Cy5 ? 兩種染料可分別對(duì)兩種蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行熒光標(biāo)記 ， 在一塊 2D膠上同步運(yùn)行 ， 可以很方便的找出差異 ? 但因其需要對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行共價(jià)修飾 、 改變了標(biāo)記蛋白質(zhì)的移動(dòng)性能 ? 由于熒光探針猝滅作用會(huì)引起快速衰減 。 蛋白與蛋白之間由于可被熒光團(tuán)修飾的功能基團(tuán)數(shù)目不同而使得靈敏度變化很大 ? 熒光團(tuán)的加入會(huì)降低蛋白質(zhì)溶解性能 。 負(fù) 染 ? 能專(zhuān)門(mén)提高 PAGE膠上蛋白質(zhì)的回收率 ， 但不能用于膜上染色 。 ? 結(jié)果表現(xiàn)為膠面著色而蛋白質(zhì)點(diǎn)透明 。 ? 速度快 （ 5~15min） ， 蛋白質(zhì)的生物活性能保持：一旦用絡(luò)合劑如 EDTA或 Tris/甘氨酸轉(zhuǎn)移緩沖液來(lái)絡(luò)合金屬離子就可進(jìn)行提取來(lái)轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì) 。 ? 它主要適用于蛋白質(zhì)顯色 、 完整蛋白質(zhì)的膠上被動(dòng)提取以及質(zhì)譜分析 。 ? 該技術(shù)主要包括金屬鹽染料 、 鋅－咪唑染料等的使用 。 pI . 100 ?g of E. coli protein 綜合的數(shù)據(jù)管理 PDQuest Image Differential Analysis Spot Cutting Protein Digestion Mass Spec PMF / MSMS Global Database Search / Protein ID PDQuest Image Autoannotation 激光捕獲顯微切割技術(shù) ? 激光捕獲顯微切割（ laser capture microdissection, LCM）技術(shù)可以精確地從組織切片中取出研究者感興趣的細(xì)胞類(lèi)型，因此 LCM技術(shù)實(shí)際上是一種原位技術(shù)。 Isolation of Subcellular Fractions Isolation of mouse liver nuclear proteins Cytoplasmic proteins Nuclei proteins pH 310 NL, 17 cm ReadyStrip IPG strips, 8 – 16% gel 激光捕獲顯微切割儀 LCM優(yōu)點(diǎn) 與不足 優(yōu)點(diǎn) ? (1)快速簡(jiǎn)單、高效直觀、減少交叉污染； ? (2)制樣靈活，使用范圍廣； ? (3)不但能有效保持分離樣品結(jié)構(gòu)的完整，而且不會(huì)破壞周?chē)R近組織的完整。 不足 ? (1)用于顯微切割的組織切片必須脫水干燥； ? (2)盡管 LCM可以獲得用于不同分子分析技術(shù)所需的幾乎純凈的細(xì)胞，但捕獲大量組織仍需要大量時(shí)間。 ? (3)組織標(biāo)本缺乏蓋玻片與屈光介質(zhì)，使得顯微鏡觀察到的組織現(xiàn)象模糊。 蛋白質(zhì)分析與鑒定技術(shù) ? Edman降解法測(cè) N端序列 ? Edman降解法測(cè)序速度慢 、 費(fèi)用偏高 、 靈敏度也不如快速發(fā)展的質(zhì)譜 ,但它測(cè)定的肽序列非常準(zhǔn)確 ， 成為蛋白
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