蛋白質(zhì)組學(xué)修ppt課件-文庫吧資料
2025-01-21 09:39本頁面
【正文】 酸轉(zhuǎn)移緩沖液來絡(luò)合金屬離子就可進(jìn)行提取來轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì) 。 負(fù) 染 ? 能專門提高 PAGE膠上蛋白質(zhì)的回收率 ， 但不能用于膜上染色 。 ? 熒光試劑顯色對(duì)蛋白質(zhì)無固定作用 ， 不干擾質(zhì)譜或免疫檢測過程 ? Cy3和 Cy5 ? 兩種染料可分別對(duì)兩種蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行熒光標(biāo)記 ， 在一塊 2D膠上同步運(yùn)行 ， 可以很方便的找出差異 ? 但因其需要對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行共價(jià)修飾 、 改變了標(biāo)記蛋白質(zhì)的移動(dòng)性能 ? 由于熒光探針猝滅作用會(huì)引起快速衰減 。 ? 快速銀染法，可與下游質(zhì)譜兼容，但其檢測靈敏度較低，并伴有很深的背景干擾。 銀染 ? 銀染的檢測靈敏度很高，可達(dá)到 200pg，但其線性很差。 ? BioSafe染料是一種改良的膠體金染色方法。 ? ReadyPrep 2D cleanup kit 二、適用于質(zhì)譜的染色方法 ? 考馬斯亮蘭（ Coomassie stain） ? 銀染（ Silver Stain ） ? 熒光染色（ SYPRO Ruby protein gel stain） 考馬斯亮藍(lán)染色 ? 考馬斯亮藍(lán)檢測范圍 30100ng，靈敏度較低，但染色過程簡單，所需試劑少，操作簡便，無毒性，染色后背景及對(duì)比度好，與下游質(zhì)譜兼容，線性程度好。 樣品中核酸的去除 ? 對(duì)電泳的影響：增加樣品粘度、與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物后會(huì)出現(xiàn)假象遷移和條紋。應(yīng)用時(shí)，兩性電解質(zhì)的濃度應(yīng)小于 ％（ w/v)。常用含自由巰基的 DTT或 ?巰基乙醇，以及不帶電荷的三丁基膦（ TBP）進(jìn)行還原。其中 CHAPS應(yīng)用最普遍。 去垢劑： 經(jīng)過離液劑處理而暴露蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)后，還常需至少一種去垢劑來溶解疏水基團(tuán)。 增加樣品溶解性的手段 離液劑： 通過改變?nèi)芤褐械臍滏I結(jié)構(gòu)使蛋白質(zhì)充分伸展，將其疏水中心完全暴露，降低接近疏水殘基的能量域。 ? 盡量去除起干擾作用的高豐度或無關(guān)蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測性。 ? 防止在樣品制備過程中發(fā)生樣品抽提后的化學(xué)修飾（如酶性或化學(xué)性降解等）。 + – pH 3 pH pH 10 + – pH 3 pH pH 10 + – pH 3 pH pH 10 + – pH 3 pH pH 10 2D Electrophoresis The 1st D: Isoelectric Focusing(IEF) IEF Theory 10 or 20 Fractions Ampholytes generate pH gradient (pH 310) pI pI pI 3 4 5 6 7 8 9 10 Anode (+) Cathode () ACID BASE Proteins Migrate to their pI ( 0 charge) IEF Theory 10 or 20 Fractions Harvest with Vacuum Source pI pI pI 3 4 5 6 7 8 9 10 Anode (+) Cathode () ACID BASE The Rotofor System A) Inject sample B) Apply current C) Focus proteins D) Harvest fractions 雙向電泳 第二向 (SDSPAGE) + – pH 3 pH pH10 – pH 3 pH pH10 charge size The 2nd D: SDSPAGE Proteins migrate through the gel at a rate proportional to their size. Smallest proteins travel the furthest distance 一、樣品制備 樣品制備基本原則 ? 使所有待分析的蛋白樣品全部處于 溶解狀態(tài) （包括多數(shù)疏水性蛋白），制備方法應(yīng)具有 可重現(xiàn)性 。雙向電泳技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中蛋白質(zhì)多肽鏈分離純化和鑒定的主要實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一。 ? 質(zhì)譜技術(shù)： 電噴霧質(zhì)譜和基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)明及發(fā)展。 ? 在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和疾病機(jī)理研究中，這些研究可能找到直接與特定生理或病理狀態(tài)相關(guān)的分子，進(jìn)一步為設(shè)計(jì)作用于特定靶分子的藥物奠定基礎(chǔ)。 很多藥物本身就是蛋白質(zhì) ， 而很多藥物的靶分子也是蛋白質(zhì) 。 2022/2/12 ： ? 蛋白質(zhì)組學(xué)的研究最終要服務(wù)于人類的健康 ， 主要指促進(jìn)分子醫(yī)學(xué)的發(fā)展 。 目前主要研究較多的為蛋白質(zhì)磷酸化，糖基化。 A B 2022/2/12 很多 mRNA表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)要經(jīng)歷翻譯后修飾如 磷酸化，糖基化，酶原激活 等。 ? 如分析酶活性和確定酶底物，細(xì)胞因子的生物分析 /配基 受體結(jié)合分析。 ? 對(duì)于闡明細(xì)胞乃至整個(gè)生命活動(dòng)的分子機(jī)制具有舉足輕重的意義。另外對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)出來后在細(xì)胞內(nèi)的定位研究也在一定程度上有助于蛋白質(zhì)功能的了解。 One Genome – Many Proteomes 2022/2/12 ： ? 可以利用一維電泳和二維電泳并結(jié)合 Western等技術(shù)，利用蛋白質(zhì)芯片和抗體芯片及免疫共沉淀等技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定研究。 ? 一個(gè)基因可以表達(dá)的蛋白質(zhì)數(shù)目可能很大。 ? 蛋白質(zhì)組學(xué)是連接基因、蛋白質(zhì)和疾病的紐帶，對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)的變化或差異的分析將具有重要的生物學(xué)意義和醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值，為闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)奠定基礎(chǔ)。 2022/2/12 2 意義 ? 每一種生命運(yùn)動(dòng)形式 ， 都是特定蛋白質(zhì)群體在不同時(shí)間和空間出現(xiàn) ， 并發(fā)揮功能的不同組合的結(jié)果。
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