【正文】 蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和 X光衍射基礎(chǔ) 分子酶學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 鄭柏松 講師 生物物理學(xué)－－生物大分子結(jié)構(gòu)解析 授課內(nèi)容 ? 歷史的回顧 ? X光衍射原理 ? 蛋白質(zhì)表達(dá)、純化 ? 蛋白質(zhì)結(jié)晶 ? X光衍射及數(shù)據(jù)收集 ? 結(jié)構(gòu)解析 授課目的 ? 了解生物物理學(xué)發(fā)展歷史與前沿； ? 掌握蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和 X光衍射基礎(chǔ)知識； ? 開闊視野－－貼近國際一流結(jié)構(gòu)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室； ? 培養(yǎng)興趣－－增強(qiáng)對科研工作的感性和理性認(rèn)識。 蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu) 測定方法 ? X射線晶體學(xué) ? 電子 顯微學(xué) (低溫電子顯微技術(shù)與三維象重構(gòu)） ? 核磁共振波譜學(xué) 1895年德國物理學(xué)家 倫琴 發(fā)現(xiàn) X射線并因此獲得 1901年首屆諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng) ， X射線歷經(jīng) 110年跨越 3個(gè)世紀(jì) ，由于眾多學(xué)者在探索 X射線性質(zhì) 、 應(yīng)用 、 儀器等方面的創(chuàng)新性研究 ， 先后有 29位物理學(xué)家 、 晶體學(xué)家 、 化學(xué)家 、分子生物學(xué)家等分別獲得了物理 （ 7項(xiàng) ） 、 化學(xué) （ 9項(xiàng) ） 、生理學(xué)或醫(yī)學(xué) （ 3項(xiàng) ） 總計(jì) 19項(xiàng)諾貝爾獎(jiǎng) 。 歷史的回顧 1912年勞厄獲得了 X射線通過晶體后產(chǎn)生的衍射斑點(diǎn)圖像（ 勞厄衍射圖 ），證明了 X射線的波動(dòng)性及其波長范圍 。隨后提出了表示原子排列周期與 X射線波長間關(guān)系的著名的衍射方程（ 勞厄方程 ），并成功地解釋了晶體衍射的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 英國物理學(xué)家布拉格父子、達(dá)爾文等人發(fā)展了 X射線衍射理論，類比光學(xué)反射原理提出了表示晶體結(jié)構(gòu)（ 晶面間距 d）、 X射線波長（ λ）與衍射方位（ ?）間的關(guān)系的布拉格方程 ，提出了 嵌鑲晶體、完整晶體 和包含有原子熱運(yùn)動(dòng)諸因素的 衍射強(qiáng)度公式 ，闡明了 X射線通過晶體產(chǎn)生衍射的付里葉變換本質(zhì)，獲得了 X射線的連續(xù)光譜與取決于陰極材料的特征光譜。 歷史的回顧 最終 X射線衍射成為有機(jī)分子（特別是生物活性分子）立體結(jié)構(gòu)測定的有力工具，為研究生理活性物質(zhì)（藥物分子）的立體結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)改造、結(jié)構(gòu)預(yù)測、結(jié)構(gòu)－功能關(guān)系為目標(biāo)的有機(jī)晶體學(xué)科奠定了基礎(chǔ)。 對于 生物大分子的研究 ， 始于 30年代中期 ，貝納爾和藿奇金開始用 X射線衍射方法研究胃蛋白酶的晶體結(jié)構(gòu)，但直到布拉格主持凱文迪實(shí)驗(yàn)室后，才使得這一工作取得突破，為創(chuàng)建 分子生物學(xué)科 奠定了基礎(chǔ)。 1953年沃森和克里克根據(jù) X衍射實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)建立了脫氧核糖核酸 (DNA)的雙螺旋結(jié)構(gòu)，并因此獲得 1962年的諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。 歷史的回顧 肯德魯和佩盧茨從 30年代開始，應(yīng)用 X衍射方法研究肌紅蛋白與血紅蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，歷經(jīng) 20多年的艱苦努力，在眾多科學(xué)家的共同參與下，終于在 1960年獲得了這兩個(gè)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，并因此榮獲 1962年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 在 1957至 1967年的 10年中，相繼用 X衍射方法測定了溶菌酶、胰島素、胰凝乳蛋白酶 A、核糖核酸酶、核糖核酸酶 S和羧肽酶的高分辨晶體結(jié)構(gòu)。 戴森豪菲爾和胡貝爾、米海爾因測定紫色細(xì)菌光合作用中心的三維結(jié)構(gòu)而獲得 1988年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，形成了新的蛋白質(zhì)晶體學(xué)科與結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)科。 歷史的回顧 X射線 X 射線和可見光一樣屬于電磁輻射，但其波長比可見光短得多，介于紫外線與γ 射線之間，約為 10－ 2 到 102 埃的范圍。 X光衍射原理 X射線 X光衍射原理 1. X 射線和其它電磁波一樣，能產(chǎn)生反射、折射、散射、干涉、衍射、偏振和吸收等現(xiàn)象。但是，在通常實(shí)驗(yàn)條件下，很難觀察到 X 射線的反射。不可能像可見光那樣用透鏡成像。對于所有的介質(zhì)， X 射線的折射率 n都很接近于 1（但小于 1），所以幾乎不能被偏折到任一有實(shí)際用途的程度。 2. 在物質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)中，原子和分子的距離（ 1 ～ 10 埃左右）正好落在 X 射線的波長范圍內(nèi)，所以物質(zhì)（特別是晶體）對 X 射線的散射和衍射能夠傳遞極為豐富的微觀結(jié)構(gòu)信息。 X 射線衍射方法是當(dāng)今研究物質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)的主要方法。 3. X 射線穿透物質(zhì)時(shí)都會被部分吸收 ,其強(qiáng)度將被衰減變?nèi)?；吸收的程度與物質(zhì)的組成、密度和厚度有關(guān)。在此過程中 X 射線與物質(zhì)的相互作用是很復(fù)雜的，會引起多種效應(yīng)。例如，可以使氣體電離；使一些物質(zhì)發(fā)出可見的熒光；能破壞物質(zhì)的化學(xué)鍵，引起化學(xué)分解，也能促使新鍵的形成，促進(jìn)物質(zhì)的合成；作用于生物細(xì)胞組織，還會導(dǎo)致生理效應(yīng)，使新陳代謝發(fā)生變化甚至造成輻射損傷。 4. X 射線散射的過程又可分為兩種，一種是只引起 X 射線方向的改變， 不引起能量變化的散射，稱為相干散射，這是 X 射線衍射的物理基礎(chǔ)；另一種是既引起 X 射線光子方向改變，也引起其能量的改變的散射，稱為不相干散射或康普頓散射（或康普頓效應(yīng)），此過程同時(shí)產(chǎn)生反沖電子（光電子）。 衍射的幾何方程 布拉格方程 勞埃（ Laue）方程 X 射線照射到晶體上發(fā)生散射，其中衍射現(xiàn)象是 X 射線被晶體散射的一種特殊表現(xiàn)。晶體的基本特征是其微觀結(jié)構(gòu)（原子、分子或離子的排列）具有周期性，當(dāng) X 射線被散射時(shí)，散射波中與入射波波長相同的相干散射波，會互相干涉，在一些特定的方向上互相加強(qiáng)，產(chǎn)生衍射線。 晶體可能產(chǎn)生衍射的方向決定于晶體微觀結(jié)構(gòu)的類型（晶胞類型）及其基本尺寸（晶面間距，晶胞參數(shù)等）；而衍射強(qiáng)度決定于晶體中各組成原子的元素種類及其分布排列的坐標(biāo)。 X光衍射原理 X光衍射原理 勞埃（ Laue）方程和布拉格（ Bragg）方程確定了衍射方向與晶體結(jié)構(gòu)基本周期的關(guān)系，通過對衍射方向的測量，理論上我們可以確定晶體結(jié)構(gòu)的對稱類型和晶胞參數(shù)。而 X射線對于晶體的衍射強(qiáng)度則決定于晶體中原子的元素種類及其排列分布的位置。 X光衍射原理 What we can do？ 挑戰(zhàn)和機(jī)遇 ？？？ ? 克隆、表達(dá)、純化 ? 結(jié)晶 ? 數(shù)據(jù)收集及處理 ? 相角的測定 ? 相角的改進(jìn)（優(yōu)化） ? 電子密度圖的解釋 ? 修正 ? 結(jié)構(gòu)的描述和與功能關(guān)系的研究 Structural Biology Processes Rebinant protein overexpression and purification Expression systems: 1. Bacteria system 2. Yeast 3. Insect cells 4. Mammalian cells 5. Cellfree system 蛋白質(zhì)表達(dá)、純化 Some Vectors for Expression System 蛋白質(zhì)表達(dá)、純化 Protein Expression in Yeast Cloning of target gene to vector Transform to yeast Pichia pastoris Selection of rebinant yeast strain Yeast cell culture for protein production 蛋白質(zhì)表達(dá)、純化 Protein Expression in Insect Cells After rebination Cloning of target gene to pFastBac Transform to bacteria with Bacmid Bacmid transfected to insect cells Virus assembly in insect cells Viruses infect Insect Cells for protein production Strains for expression: Sf9, Sf21, Hi5 蛋白質(zhì)表達(dá)、純化 Transient Expression In Mammalian Cells 293E cell can be cultured in suspension medium Rebinant plasmid with target gene Transfect to 293E cells with PEI Harvest cells for protein purification 蛋白質(zhì)表達(dá)、純化 293EBNA1 Cells With GFP Expressing Vector A B A. Whole cells on plate。 B. Cells in the same plate to A viewed by GFP florescence 蛋白質(zhì)表達(dá)、純化 Rebinant Proteins Expression In 293EBNA1 Cells Lanes: 1. Protein standard。 2. Control whole 293E cells。 3. GFP expressed 293E cells。 4. HCF1N380 expressed 293E cells。 5. HCF1N16363 expressed 293E cells. Rebinant protein 1 (lane 4) 1 2 3 4 5 14 20 31 45 67 94 Rebinant protein 2 (lane 5) GFP (lane3) 蛋白質(zhì)表達(dá)、純化 Cellfree System for Protein Production Sometimes it can produce soluble protein which can