【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 tRNA的反應(yīng)液中保溫后通過(guò)硝酸纖維素濾膜，只有游離的AAtRNA因相對(duì)分子質(zhì)量小而通過(guò)濾膜，而核糖體或與核糖體結(jié)合的AAtRNA則留在濾膜上，這樣可把已結(jié)合與未結(jié)合的AAtRNA分開(kāi)。當(dāng)體系中帶有多聚核苷酸模板時(shí)，從大腸桿菌中提取的核糖體經(jīng)常與特異性氨基酰tRNA相結(jié)合。如果把核糖體與poly（U）和PhetRNAPhe共溫育，核糖體就能同時(shí)與poly（U）和PhetRNAPhe相結(jié)合。 4種核苷酸組成61個(gè)編碼氨基酸的密碼子和3個(gè)終止密碼子，它們不能與tRNA的反密碼子配對(duì)，但能被終止因子或釋放因子識(shí)別，終止肽鏈的合成。由一種以上密碼子編碼同一個(gè)氨基酸的現(xiàn)象稱(chēng)為簡(jiǎn)并（degeneracy），對(duì)應(yīng)于同一氨基酸的密碼子稱(chēng)為同義密碼子（synonymous codon）。三．密碼子和反密碼子的相互作用蛋白質(zhì)生物合成過(guò)程中，tRNA的反密碼子通過(guò)堿基的反向配對(duì)與mRNA的密碼子相互作用。1966年，Crick根據(jù)立體化學(xué)原理提出擺動(dòng)假說(shuō)（wobble hypothesis），解釋了反密碼子中某些稀有成分如I以及許多有2個(gè)以上同源密碼子的配對(duì)問(wèn)題。Wobble hypothesis① 任意一個(gè)密碼子的前兩位堿基都與tRNA anticodon中的相應(yīng)堿基形成WatsonCrick堿基配對(duì)。② 反密碼子第一位是A或C時(shí)，只能識(shí)別一個(gè)密碼子。當(dāng)反密碼子第一位是U或G時(shí)，能識(shí)別兩個(gè)密碼子。當(dāng)Inosine（I）作為反密碼子第一位時(shí)，能識(shí)別三個(gè)密碼子。③ 如果數(shù)個(gè)密碼子同時(shí)編碼一個(gè)氨基酸，凡是第一、二位堿基不相同的密碼子都對(duì)應(yīng)于各自的tRNA。④ 根據(jù)上述規(guī)則，至少需要32種不同的tRNA才能翻譯61個(gè)密碼子。四．tRNAtRNA在蛋白質(zhì)合成中處于關(guān)鍵地位，被稱(chēng)為第二遺傳密碼。它不但為將每個(gè)三聯(lián)子密碼翻譯成氨基酸提供了接合體，還為準(zhǔn)確無(wú)誤地將所需氨基酸運(yùn)送到核糖體上提供了載體。所有的tRNA都能夠與核糖體的P位點(diǎn)和A位點(diǎn)結(jié)合，此時(shí)，tRNA分子三葉草型頂端突起部位通過(guò)密碼子：反密碼子的配對(duì)與mRNA相結(jié)合，而其3’末端恰好將所轉(zhuǎn)運(yùn)的氨基酸送到正在延伸的多肽上。代表相同氨基酸的tRNA稱(chēng)為同工tRNA。在一個(gè)同工tRNA組內(nèi)，所有tRNA均專(zhuān)一于相同的氨基酰 tRNA合成酶。tRNA的三葉草型二級(jí)結(jié)構(gòu)受體臂（acceptor arm）主要由鏈兩端序列堿基配對(duì)形成的桿狀結(jié)構(gòu)和3’端末配對(duì)的34個(gè)堿基所組成，其3’端的最后3個(gè)堿基序列永遠(yuǎn)是CCA，最后一個(gè)堿基的3’或2’自由羥基（—OH）可以被氨?；φC臂是根據(jù)3個(gè)核苷酸命名的，其中φ表示擬尿嘧啶，是tRNA分子所擁有的不常見(jiàn)核苷酸。反密碼子臂是根據(jù)位于套索中央的三聯(lián)反密碼子命名的。D臂是根據(jù)它含有二氫尿嘧啶（dihydrouracil）命名的。最常見(jiàn)的tRNA分子有76個(gè)堿基，104。不同的tRNA分子可有7495個(gè)核苷酸不等，tRNA分子長(zhǎng)度的不同主要是由其中的兩條手臂引起的。tRNA的稀有堿基含量非常豐富，約有70余種。每個(gè)tRNA分子至少含有2個(gè)稀有堿基，最多有19個(gè)，多數(shù)分布在非配對(duì)區(qū)，特別是在反密碼子339。端鄰近部位出現(xiàn)的頻率最高，且大多為嘌呤核苷酸。這對(duì)于維持反密碼子環(huán)的穩(wěn)定性及密碼子、反密碼子之間的配對(duì)是很重要的。2．tRNA的L形三級(jí)結(jié)構(gòu)酵母和大腸桿菌tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)都呈L形折疊式。這種結(jié)構(gòu)是靠氫鍵來(lái)維持的，tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)與AA tRNA合成酶的識(shí)別有關(guān)。受體臂和TφC臂的桿狀區(qū)域構(gòu)成了第一個(gè)雙螺旋，D臂和反密碼子臂的桿狀區(qū)域形成了第二個(gè)雙螺旋。tRNA的L形高級(jí)結(jié)構(gòu)反映了其生物學(xué)功能，因?yàn)樗纤\(yùn)載的氨基酸必須靠近位于核糖體大亞基上的多肽合成位點(diǎn)，而它的反密碼子必須與小亞基上的mRNA相配對(duì)，所以?xún)蓚€(gè)不同的功能基團(tuán)最大限度分離。3．tRNA的功能轉(zhuǎn)錄過(guò)程是信息從一種核酸分子（DNA）轉(zhuǎn)移至另一種結(jié)構(gòu)上極為相似的核酸分子（RNA）的過(guò)程，信息轉(zhuǎn)移靠的是堿基配對(duì)。翻譯階段遺傳信息從mRNA分子轉(zhuǎn)移到結(jié)構(gòu)極不相同的蛋白質(zhì)分子，信息是以能被翻譯成單個(gè)氨基酸的三聯(lián)子密碼形式存在的，在這里起作用的是解碼機(jī)制。4．tRNA的種類(lèi)（1）起始tRNA和延伸tRNA能特異地識(shí)別mRNA模板上起始密碼子的tRNA叫起始tRNA，其他tRNA統(tǒng)稱(chēng)為延伸tRNA。原核生物起始tRNA攜帶甲酰甲硫氨酸（fMet），真核生物起始tRNA攜帶甲硫氨酸（Met）。（2）同工tRNA代表同一種氨基酸的tRNA稱(chēng)為同工tRNA，同工tRNA既要有不同的反密碼子以識(shí)別該氨基酸的各種同義密碼，又要有某種結(jié)構(gòu)上的共同性，能被AA tRNA合成酶識(shí)別。（3）校正tRNA校正tRNA分為無(wú)義突變及錯(cuò)義突變校正。在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因中，一個(gè)核苷酸的改變可能使代表某個(gè)氨基酸的密碼子變成終止密碼子（UAG、UGA、UAA），使蛋白質(zhì)合成提前終止，合成無(wú)功能的或無(wú)意義的多肽，這種突變就稱(chēng)為無(wú)義突變。五．AA tRNA合成酶 是一類(lèi)催化氨基酸與tRNA結(jié)合的特異性酶，其反應(yīng)式如下：它實(shí)際上包括兩步反應(yīng)：第一步是氨基酸活化生成酶氨基酰腺苷酸復(fù)合物。AA+ATP+酶（E）→EAAAMP+PPi第二步是氨酰基轉(zhuǎn)移到tRNA 3’末端腺苷殘基上，與其2’或3’羥基結(jié)合。EAAAMP+ tRNA→AA tRNA +E+AMP 蛋白質(zhì)合成的真實(shí)性主要決定于AA tRNA合成酶是否能使氨基酸與對(duì)應(yīng)的tRNA相結(jié)合。AAtRNA合成酶既要能識(shí)別tRNA，又要能識(shí)別氨基酸，它對(duì)兩者都具有高度的專(zhuān)一性。不同的tRNA有不同堿基組成和空間結(jié)構(gòu)，容易被tRNA合成酶所識(shí)別，困難的是這些酶如何識(shí)別結(jié)構(gòu)上非常相似的氨基酸。 有兩道關(guān)口:The first filter is the initial binding of the amino acid to the enzyme and its activation to aminoacylAMP. The second filter is the binding of incorrect aminoacylAMP products to a separate active site on the enzyme. 核糖體像一個(gè)能沿mRNA模板移動(dòng)的工廠，執(zhí)行著蛋白質(zhì)合成的功能。它是由幾十種蛋白質(zhì)和幾種核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）組成的亞細(xì)胞顆粒。一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)約有20000個(gè)核糖體，而真核細(xì)胞內(nèi)可達(dá)106個(gè)，在未成熟的蟾蜍卵細(xì)胞內(nèi)則高達(dá)1012。核糖體和它的輔助因子為蛋白質(zhì)合成提供了必要條件。原核生物核糖體由約2/3的RNA及1/3的蛋白質(zhì)組成。真核生物核糖體中RNA占3/5，蛋白質(zhì)占2/5。核糖體是一個(gè)致密的核糖核蛋白顆粒，可以解離為兩個(gè)亞基，每個(gè)亞基都含有一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量較大的rRNA和許多不同的蛋白質(zhì)分子。大腸桿菌核糖體小亞基由21種蛋白質(zhì)組成，分別用S1……S21表示，大亞基由33種蛋白質(zhì)組成，分別用L1……L33表示。真核生物細(xì)胞核糖體大亞基含有49種蛋白質(zhì)，小亞基有33種蛋白質(zhì)。 rRNA核糖體包括至少5個(gè)活性中心，即mRNA結(jié)合部位、結(jié)合或接受AA tRNA部位（A位）、結(jié)合或接受肽基tRNA的部位、肽基轉(zhuǎn)移部位（P位）及形成肽鍵的部位（轉(zhuǎn)肽酶中心），此外還有負(fù)責(zé)肽鏈延伸的各種延伸因子的結(jié)合位點(diǎn)。小亞基上擁有mRNA結(jié)合位點(diǎn)，負(fù)責(zé)對(duì)序列特異的識(shí)別過(guò)程，如起始位點(diǎn)的識(shí)別和密碼子與反密碼子的相互作用。大亞基負(fù)責(zé)氨基酸及tRNA攜帶的功能，如肽鍵的形成、AA tRNA、肽基 tRNA的結(jié)合等。A位、P位、轉(zhuǎn)肽酶中心等主要在大亞基上。核糖體可解離為亞基或結(jié)合成70S/80S顆粒。翻譯的起始階段需要游離的亞基，隨后才結(jié)合成70S/80S顆粒，繼續(xù)翻譯進(jìn)程。體外反應(yīng)體系中，核糖體的解離或結(jié)合取決于Mg2+離子濃度。在大腸桿菌內(nèi)，Mg2+濃度在103mol/L以下時(shí)，70S解離為亞基，濃度達(dá)102mol/L時(shí)則形成穩(wěn)定的70S顆粒。細(xì)胞中大多數(shù)核糖體處于非活性的穩(wěn)定狀態(tài)，單獨(dú)存在，只有少數(shù)與mRNA一起形成多聚核糖體。它從mRNA的539。末端向339。末端閱讀密碼子，至終止子時(shí)合成一條完整的多肽鏈。mRNA上核糖體的多少視mRNA的長(zhǎng)短而定，一般40個(gè)核苷酸有一個(gè)核糖體。七. 信使核糖核酸mRNA messenger ribonucleic acidDNA deoxyribonucleic acid.雖然mRNA在所有細(xì)胞內(nèi)執(zhí)行著相同的功能，即通過(guò)三聯(lián)子密碼翻譯生成蛋白質(zhì)，其生物合成的具體過(guò)程和成熟mRNA的結(jié)構(gòu)在原核和真核生物細(xì)胞內(nèi)是不同的。八、蛋白質(zhì)的生物合成核糖體是蛋白質(zhì)合成的場(chǎng)所，mRNA是蛋白質(zhì)合成的模板，tRNA是模板與氨基酸之間的接合體。此外，有20種以上的AAtRNA及合成酶、10多種起始因子、延伸因子及終止因子，30多種tRNA及各種rRNA、mRNA和100種以上翻譯后加工酶參與蛋白質(zhì)合成和加工過(guò)程。蛋白質(zhì)合成消耗了細(xì)胞中90%左右用于生物合成反應(yīng)的能量。細(xì)菌細(xì)胞中的2萬(wàn)個(gè)核糖體，10萬(wàn)個(gè)蛋白質(zhì)因子和20萬(wàn)個(gè)tRNAs 約占大腸桿菌干重的35%。在大腸桿菌中合成一個(gè)100個(gè)氨基酸的多肽只需5分鐘。：翻譯的起始——核糖體與mRNA結(jié)合并與氨基酰tRNA生成起始復(fù)合物。肽鏈的延伸——核糖體沿mRNA5’端向3’端移動(dòng)，導(dǎo)致從N端向C端的多肽合成。肽鏈的終止以及肽鏈的釋放——核糖體從mRNA上解離，準(zhǔn)備新一輪合成反應(yīng)。主要分為五步 Activation of Amino Acids (This reaction takes place in the cytosol, not on the ribosome). Initiation. The mRNA bearing the code for the polypeptide binds to the small ribosomal subunit and to the initiating aminoacyltRNA.Elongation. Peptide bonds are formed in this stage.Termination and Release. Completion of the polypeptide chain is signaled by a termination codon in the mRNA.Folding and Post translational Processing.肽鏈延伸分為三步① Binding of an ining aminoacyltRNA.② Peptide bond formation.③ Translocation.起始因子Initiation factor（IF）延伸因子Elongation factor（EF）終止因子。原核中有RF13。RF1 識(shí)別 UAA和UAG。 RF2 識(shí)別 UAA和UGA。 RF3 僅能促進(jìn)RF1和RF2的功能。終止因子行使功能時(shí)需要GTP。真核生物中只有一個(gè)RF，能識(shí)別3個(gè)終止子。蛋白質(zhì)合成的起始蛋白質(zhì)合成的起始復(fù)合物:30S 核糖體小亞基模板mRNAfMettRNAfMet起始因子GTP50S 核糖體大亞基Mg2+合成的起始可分為三步:30S 核糖體小亞基與起始因子IF –1和IF3相結(jié)合，誘發(fā)模板mRNA與小亞基結(jié)合。由30S 小亞基、起始因子IF –1和IF3及模板mRNA所組成的復(fù)合物立即與GTPIF2及fMettRNAfMet相結(jié)合。反密碼子與密碼子配對(duì)。上述六組分復(fù)合物再與50S大亞基結(jié)合，水解GTP生成并釋放GDP和Pi。釋放三個(gè)起始因子。表279 真核細(xì)胞中參與翻譯起始的蛋白質(zhì)因子及其功能真核因子 功能 eIF2 促進(jìn)MettRNAMet與核糖體40S小亞基結(jié)合。 eIF2B eIF3 是最早與核糖體40S小亞基結(jié)合的促進(jìn)因子，蛋白質(zhì)合成反應(yīng)的正常進(jìn)行。 eIF4A 具有RNA解旋酶活性，解除mRNA模板的次級(jí)結(jié)構(gòu)并使之與40S小亞基結(jié)合，形成eIF4F復(fù)合物。 eIF4B 與mRNA模板相結(jié)合，協(xié)助核糖體掃描模板序列，定位AUG。 eIF4E 與mRNA 539。的帽子結(jié)構(gòu)相結(jié)合，形成eIF4F復(fù)合物。 eIF4G 與eIF4E和poly（A）結(jié)合蛋白（PAB）相結(jié)合，形成eIF4F復(fù)合物。 eIF5 促使多個(gè)蛋白因子與40S小亞基解體，以此幫助大小亞基結(jié)合形成80核糖體，形成翻譯起始復(fù)合物。 eIF6 促進(jìn)沒(méi)有蛋白質(zhì)合成活性的80S核糖體解離成40S和60S兩個(gè)亞基。 　肽鏈的延伸 肽鏈延伸的基本要求是 ：有完整的起始復(fù)合物， 有氨基酰tRNA， 有延伸因子EFTu, EFTs和EFG， 有GTP。 肽鏈延伸也可被分為三步： 第一步，與新進(jìn)來(lái)的氨基酰tRNA相結(jié)合。氨基酰tRNA首先必須與GTPEFTu復(fù)合物相結(jié)合，形成氨基酰tRNAGTPEFTu復(fù)合物并與70S中的A位點(diǎn)相結(jié)合。此時(shí)，GTP水解并釋放GDPEFTu復(fù)合物。 第二步，肽鍵形成。 肽鍵形成之初，兩個(gè)氨基酸仍然分別與各自的tRNA相結(jié)合，仍然分別位于A位點(diǎn)和P位點(diǎn)上。A位點(diǎn)上的氨基酸（第二個(gè)氨基酸）中的α氨基作為親核基團(tuán)取代了P位點(diǎn)上的tRNA，并與起始氨基酸中的COOH基團(tuán)形成肽鍵。本反應(yīng)可能由peptidyl transferase 催化。第三步，移位（translocation）。 核糖體向mRNA的3’方向移動(dòng)一個(gè)密碼子，使得帶有第二個(gè)氨基酸（現(xiàn)已成為二肽）的tRNA從A位進(jìn)入P位，并使第一個(gè)tRNA從P位進(jìn)入E位。此時(shí)模板上的第三個(gè)密碼子正好在A位上。核糖體的移位需要EFG（translocase）和另一分子GTP水解提供能量。 肽鏈的終止當(dāng)終止密碼子進(jìn)入