【文章內(nèi)容簡介】 胰酶消化肉瓊脂（赫氏瓊脂）加入亞硫酸鈉或脫纖維血有刺激生長，用腐敗材料分離，培養(yǎng)基中加入甲紫、膽酸鈉抑制雜菌，龍膽紫亞硫酸鈉為其選擇性培養(yǎng)基，3%氯化鈉上生長呈多形性。小腸耶爾森：無動無芽無莢G－，25℃有動力，有周鞭毛，最適溫20～28℃，VP試驗(yàn)25℃陽性，37℃陰性，KIA只利用葡萄糖，MIU22℃動力陽性37℃陰性。假結(jié)核：25℃有周鞭毛有動力37℃無動力，最適溫30℃，pH6～8。血清檢測的抗體是F1經(jīng)典鼠疫“四步檢驗(yàn)”：顯微鏡檢查（美蘭染色）、培養(yǎng)、鼠疫噬菌體裂解試驗(yàn)（早期為暗黃的灰色表面粗糙的顆粒樣突起，在血培養(yǎng)上有花邊狀薄而透明不整齊的邊緣菌落。48小時(shí)為灰白色中央突起菌落，）、動物實(shí)驗(yàn)（小鼠、豚鼠）?？焖贆z測；PCR（高度特異性基因：fra、pla、inu、hms）、免疫檢測（F1抗原）所有疑似鼠疫病人都需采取血標(biāo)本，疑似腺鼠疫病人取腫大淋巴結(jié)穿剌液；肺鼠疫病人取咳痰、咽拭子標(biāo)本。80. 枸櫞酸桿菌：有弗勞地，異型，無丙二酸鹽。只有弗勞地靛基質(zhì)－，H2S＋，僅異型的丙二酸鹽＋，β半乳糖苷酶，賴氨酸脫羧酶，枸櫞酸利用三試驗(yàn)：枸櫞酸菌＋－＋，沙門－/＋＋＋，愛德華－＋－。：免疫層析技術(shù)。其優(yōu)點(diǎn)標(biāo)記物非常穩(wěn)定。，能使明膠分解為氨基酸而液化。氧化酶試驗(yàn)用于腸桿菌科與假單胞菌的鑒別。膽汁溶菌試驗(yàn)用于肺炎鏈球菌與甲型鏈球菌鑒別ONPG試驗(yàn)—遲緩分解乳糖的細(xì)菌試驗(yàn)為陽性。83. 沙雷菌：最適溫10～36℃，4%氯化鈉下可長，產(chǎn)生靈紅霉素（非水溶）和吡羧酸（水溶），關(guān)鍵生化是DNA＋和葡萄糖酸鹽＋。85. 霍亂菌：呈弧狀或逗點(diǎn)狀，米泔樣糞便作懸滴觀察，細(xì)菌呈穿梭樣或流星狀運(yùn)動；糞便涂片鏡檢見排列如“魚群”狀G－菌，耐堿不耐酸。血清分型可分為AB的小川型，AC的稻葉型，ABC的彥島型病原分離：水樣便直接接種在硫代硫酸鹽－檸檬酸鹽－膽鹽－蔗糖平板（TCBS）上37℃形成較大黃菌落，在含亞碲酸鉀或慶大霉素平板選擇性平板上呈灰褐色。食品及水樣常用堿性蛋白胨水增菌培養(yǎng)后再接種，鈉離子可剌激生長，但在＞8%NaACI中不生長。常用的保存或運(yùn)送及增菌用堿性蛋白胨水，文臘二氏，卡布。病原鑒定： O1群無芽胞，無莢膜，單一鞭毛 ；O139群菌體周圍有一層比較薄的莢膜。測定耐熱的特異性O(shè)抗原，用玻片凝集或ELISA鑒定， 血清效價(jià)1：401：50。不耐熱的非特異性H抗原，有兩個(gè)環(huán)狀染色體，即染色體染色體2。深入鑒定：流行株與非流行株依靠噬菌體生物分型法。噬菌體（VP1VP5）將埃爾托型霍亂弧菌分成32個(gè)噬菌體型。根據(jù)溶原性、溶原噬菌體的敏感性、山梨醇發(fā)酵試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)，將埃爾托型霍亂弧菌分成al共12個(gè)生物型。常見的流行株為噬菌體13型，生物型ad型，常見的有：la、lb、ld。產(chǎn)毒基因鑒定：用PCR檢測ct基因，流行株常帶有霍亂腸毒素。免疫檢測：霍亂為腸為非侵襲性細(xì)菌，主要剌激局部黏膜產(chǎn)生分泌性AgA抗體，同時(shí)大量毒素及細(xì)菌脂多糖體的產(chǎn)生使機(jī)體產(chǎn)生抗毒和抗菌抗體?；謴?fù)期帶菌者是指臨床癥狀消失后3個(gè)月內(nèi)帶菌者，恢復(fù)期帶菌的時(shí)間一般不超過 2 周，健康帶菌者的排菌時(shí)間一般不超過7天。86. 副溶血弧菌：嗜鹽性弧菌（與霍亂顯著區(qū)別），是我國沿海地區(qū)最常見的食物中毒病原菌，兩極濃染，NaCl最適35g/L，無鹽不長，～，最適pH ，不耐熱，不耐酸，在TCBS上不發(fā)酵蔗糖菌落綠色，＞80g/L鹽內(nèi)不長，神奈川現(xiàn)象（β溶血），KP+是致病株能使人或兔紅細(xì)胞發(fā)生溶血對馬紅細(xì)胞不溶血為陽性。87. 氣單胞菌最適生長溫度30℃，但在0～45℃皆可生長。88. 彎曲菌屬是一類微需氧菌，不分解糖，氧化酶+，菌體彎曲逞豆點(diǎn)狀，S狀或螺旋狀有動力G－菌，5種5亞種，對人致病的主要是空腸彎曲菌（人類腹瀉最常見之一，43℃生長，25℃不生長）89. 幽門螺桿菌（HP）：常用布氏培養(yǎng)基或腦心浸液血瓊脂加入5～10%羊血和馬血，在（85%N、10%CO5%O2）條件下，37℃3—7天，長成針尖狀的半透明菌落，加入萬古霉素、TMP、兩性霉素B等組成抑菌劑防止雜菌生長。與十二脂腸潰瘍、胃癌、胃淋巴瘤發(fā)病有關(guān)。傳染源主要是人，糞口途徑。標(biāo)本：胃黏膜活檢組織；病原鑒定：生物特性是具有大量高活性的尿素酶，迅速分解尿素，氧化酶＋、觸酶＋，具有堿性磷酸酶、r谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性，硝酸鹽還原＋，可生長于5%甘氨酸、%氯化三苯四氮唑培養(yǎng)基中，三糖鐵中不產(chǎn)生硫化氫，微需氧5～8%，37℃生長，25℃和42℃均不生長的G－菌，初次分離要3～4天?？焖贆z測：尿素呼吸試驗(yàn)簡單快捷，可以特異地診斷HP現(xiàn)癥感染，敏感性高。主要采用13C、14C（放射性同位素）標(biāo)記尿素，13C用于兒童和孕婦。90.《伯杰系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)分類》的標(biāo)準(zhǔn)：G染特性，形態(tài)，鞭毛，芽胞，莢膜，代謝產(chǎn)物。91. 有芽胞的厭氧菌：只有梭菌屬包括83個(gè)種。厭氧菌每克糞中高達(dá)1012個(gè)，標(biāo)本絕不能被正常菌污染，應(yīng)盡量避免接觸空氣。最理想的標(biāo)本是組織，送到實(shí)驗(yàn)室后20～30min內(nèi)處理完不超過2h。應(yīng)接種固體和液體兩種培養(yǎng)基，應(yīng)使用預(yù)還原培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基應(yīng)煮沸10min以驅(qū)氧并立即冷卻。每份標(biāo)本至少接種三個(gè)血平板，置于有氧，無氧，5%～10%CO2環(huán)境中培養(yǎng)。厭氧手套箱培養(yǎng)法是迄今最佳厭氧培養(yǎng)儀器之一。92. 厭氧狀態(tài)的指示劑有：美藍(lán)和刃天青，無氧時(shí)白色，有氧時(shí)美藍(lán)藍(lán)色，刃天青粉紅色。紫外線下出現(xiàn)熒光也是厭氧菌參考之一，卡那霉素用于梭桿菌與類桿菌的區(qū)分，甲硝唑用于厭氧菌和非厭氧菌的區(qū)別。氣液相色譜已成為鑒定厭氧菌及其分類比較可靠的方法。93. 破傷風(fēng)桿菌：鼓槌狀，早期培養(yǎng)G＋，48h后特別是芽胞形成后G－，的O和H抗原，主要癥狀為骨骼肌痙攣，不發(fā)酵糖類，能液化明膠產(chǎn)H2S。產(chǎn)生兩種外毒素：破傷風(fēng)溶血素、破傷風(fēng)痙攣毒素94. 產(chǎn)氣莢膜梭菌：G＋，20～50℃均能生長，最適為45℃，雙層溶血，可分解糖類產(chǎn)酸產(chǎn)氣，出現(xiàn)洶涌發(fā)酵現(xiàn)象，分5型，主要是A型，外毒素以A毒素為主，本質(zhì)是卵磷脂酶（α毒素），在蛋黃瓊脂平板上菌落周圍出現(xiàn)乳白色渾濁圈。所致疾病為氣性壞疽，有捻發(fā)感，青霉素為首選，萬古為次選。95. 肉毒梭菌：G+，芽胞膠囊于次極端呈湯匙狀或網(wǎng)球拍狀，嚴(yán)格厭氧，8型，以A，B多見，毒素不耐熱，1min煮沸即死。96. 無芽胞厭氧菌是一大類正常菌群，引起感染是內(nèi)源性感染。97. 白喉棒狀桿菌：為放線菌，G+，無莢無芽無鞭無毛，奈瑟（Neisser）染色成黃褐色，一端或兩端染成藍(lán)色或深藍(lán)色顆粒即異染顆粒，阿培特（Albert）染色菌體呈藍(lán)綠色，異染顆粒成藍(lán)黑色。分離培養(yǎng)：棉拭子取咽喉部、鼻腔、皮膚病變部位，血平板，呂氏血清斜面（生長迅速，乳白色，S型，形態(tài)典型），哥倫比亞血培養(yǎng)基及亞碲酸鉀血瓊脂（48小時(shí)以上，菌落黑色，篩選鑒別）。白喉毒素是一種毒性強(qiáng)、抗原性強(qiáng)的蛋白質(zhì)，B棒狀桿菌噬菌體毒素基因（tox+）編碼的蛋白質(zhì)，PCR擴(kuò)增tox+基因輔助診斷不能確診。免疫沉淀試驗(yàn)（EleK平板試驗(yàn)）檢測產(chǎn)生白喉外毒素，是診斷白喉的關(guān)鍵試驗(yàn)。細(xì)菌一般不侵入血，但外毒素可入血引起毒血癥，不能立即送檢時(shí)應(yīng)浸于無菌生理鹽水或15%甘油鹽水中。出現(xiàn)各種心肌炎，軟腭麻痹是白喉晚期死亡的主要原因。（白喉類毒素、百日咳菌苗、破傷風(fēng)類毒素的混合疫苗DPT） 98. 百日咳鮑特菌：專性需氧，常用包姜培養(yǎng)基（含青霉素G）細(xì)小S銀灰色不透明珍珠狀菌落，在加血培養(yǎng)基上,周圍有狨毛狀狹窄溶血環(huán)，液體培養(yǎng)基中混濁生長。菌落常SR相變異，Ⅰ相S型，Ⅱ、Ⅲ相過渡型，Ⅳ相R型。有百日咳毒素，絲狀血細(xì)胞凝聚素和腺嘌呤環(huán)化毒素。細(xì)菌不進(jìn)入血流。臨床分為3個(gè)期：卡他期痙咳期恢復(fù)期。依據(jù)菌落性狀及凝集試驗(yàn)確診。抗原有PT、FHA，主要用ELISA方法?？色@持久免疫力咳碟法：包姜培養(yǎng)基（含青霉素G）置10cm使飛沫直射于培養(yǎng)基上，37℃23天鼻咽拭子法：—%蛋白胨生理鹽水中2小時(shí)內(nèi)檢 99. TBETris硼酸緩沖液，長時(shí)間電泳選用。MIC最小抑菌濃度101．決定細(xì)菌的形態(tài)因素：培養(yǎng)基的成份、PH、培養(yǎng)時(shí)間、溫度。直接觀察細(xì)菌的超微結(jié)構(gòu)：超薄切片技術(shù)、電子顯微鏡。102. 芽胞：在80℃水中迅速死亡，在100℃水中能耐受2小時(shí)以上，在70%乙醇中能存活20年。高壓蒸氣滅菌殺死細(xì)菌牙芽胞最有效。莢膜的重要功能：抗吞噬。是構(gòu)成細(xì)菌毒力的因素之一。衛(wèi)生毒理學(xué)1．外源化學(xué)物在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)運(yùn)：吸收、分布、代謝、排泄四階段?；瘜W(xué)毒物在體內(nèi)的代謝分為兩相：Ⅰ反應(yīng)氧化、還原、水解；Ⅱ反應(yīng)與體內(nèi)源性物質(zhì)結(jié)合亞慢性毒性試驗(yàn)?zāi)康模鹤畲鬅o作用劑量、最大耐受劑量估測閾劑量。（選用兩種種屬及嚙齒類、非嚙齒類，初斷乳動物）慢性毒性試驗(yàn)?zāi)康模鹤钚∮凶饔脛┝俊㈤搫┝?、最大未觀察到有害作用劑量（選用兩種種屬及嚙齒類、非嚙齒類，初斷乳動物）危害性評價(jià)組成：認(rèn)定、描述、接觸評定、特征分析毒理學(xué)試驗(yàn)項(xiàng)目：第一階段：急性毒性試驗(yàn)。第二階段：遺傳毒性試驗(yàn)。第三階段：亞慢性毒性試驗(yàn)。第四階段：慢性毒性試驗(yàn)和致癌試驗(yàn)GB 19489—2004《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》分級：危害等級Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。生物安全防護(hù)水平（BSL4）。生物安全柜一級：可保護(hù)工作人員和環(huán)境。生物安全柜二級：分AABB2可保護(hù)工作人員、環(huán)境、樣品。生物安全柜三級：2．普通光學(xué)顯微鏡：,不能觀察細(xì)菌的亞結(jié)構(gòu)3．暗視野顯微鏡：,、 mm4．熒光顯微鏡：5．—,。微量吸管5—1000ul。培養(yǎng)皿分：10cm蛋白質(zhì)、核酸提取及相關(guān)設(shè)備一、蛋白質(zhì)分離純化實(shí)驗(yàn)室常用鹽析法（硫酸銨）。核酸純化酚、氯仿抽提制備細(xì)胞外膜蛋白超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)。大多數(shù)限制內(nèi)切酶使用溫度37℃，保存溫度是20℃。二、層析凝膠過濾法（分子篩層析法）主要用于蛋白或核酸分離。介質(zhì)：葡聚糖。過濾中先洗脫的是大分子物質(zhì)，后小分子物質(zhì)。原理：纖維素或凝膠介質(zhì)帶電荷不同。三、檢測儀 分光光度計(jì)及檢測物質(zhì)分光光度計(jì)波長nm比色皿檢測細(xì)菌濃度可見分光光度計(jì)600玻璃測定顏色可見分光光度計(jì)450檢測蛋白紫外分光光度計(jì)280石英檢測核酸紫外分光光度計(jì)260石英紫外透射儀：暗室紫外線下看DNA條帶。測序儀：蛋白測序儀測定氨基酸排列順序 DNA測序儀測核苷酸排列順序。物質(zhì)是；質(zhì)粒、噬菌體、PCR產(chǎn)物擴(kuò)增儀：能做PCR稱DNA擴(kuò)增數(shù) 酶標(biāo)儀：二、電泳類：用于原 理聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）蛋白質(zhì)、核酸分離用垂直電泳槽，凝膠介質(zhì)形成立體多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，過硫酸銨起催化聚合作用, Tris甘氨酸緩沖液。分離DNA片段最佳范圍5500bp十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）蛋白分離聚丙烯酰胺濃度越大，線性分離范圍越小。十二烷基硫酸鈉作用是解離蛋白，常用蛋白染料考馬斯亮藍(lán)，甘氨酸—緩沖瓊脂免疫電泳蛋白分離和鑒定脈沖電場凝膠電泳（PFGE）核酸分離用瓊脂糖作介質(zhì)。為正交的交變脈沖電場；條帶靠近負(fù)極為大片段DNA，靠近正極為小片段DNA。DNA染色用溴化乙錠（EB）或硝酸銀。（分析大分子物質(zhì)）瓊脂糖凝膠電泳核酸分離與純化1%瓊脂糖作支持介質(zhì)，有“分子篩”和“電泳”的雙重作用。用水平電泳槽，充分分離DNA片段最佳范圍200bp50kb等電聚焦電泳（IFE）蛋白質(zhì)分離以兩性電解質(zhì)制造凝膠有不同PH，使帶不同電荷的多肽在電泳條件下于等電點(diǎn)停留。用聚丙烯酰胺制備等電聚焦電泳凝膠。濃縮效應(yīng)、分辨率高、重復(fù)性好、用時(shí)少對流免疫電泳（CIE）測定抗體或抗原，使抗原抗體均帶負(fù)電，抗原向正泳，抗體電滲作用向負(fù)泳。火箭電泳測抗原量交叉定量免疫電泳醋酸纖維膜電泳免疫球蛋白鑒定變性聚丙烯酰胺凝膠單鏈（DNA或RNA）片段分離與純化四、快速斑點(diǎn)免疫金滲濾法（滴金免疫法）：屬于常用的膠體金技術(shù)。方法是以硝酸纖維素膜（NC膜）為載體，將試劑和標(biāo)本滴加在膜上，通過滲濾而逐步反應(yīng)，全程可于數(shù)分鐘內(nèi)完成，陽性在膜上呈紅色斑點(diǎn)?；驹硎情g接法或夾心法免疫膠體金技術(shù)用于檢測：抗原、半抗原、抗體ATCC是指美國典型培養(yǎng)物保藏中心。MPS單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)，又稱巨噬細(xì)胞系統(tǒng)。玻片凝集反應(yīng)23分鐘看結(jié)果；試管凝集反應(yīng)18—24小時(shí)看結(jié)果；沉淀反應(yīng)72小時(shí)看結(jié)果；補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT）30分鐘看結(jié)果過濾式微生物采樣器根據(jù)過濾材料不同有：薄膜過濾器、玻璃纖維過濾器、凝膠過濾器、谷氨酸堿過濾器。病毒的分子生物學(xué)鑒定：病毒核酸和蛋白質(zhì)測定。蛋白質(zhì)使用免疫測定技術(shù)、電泳技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)；核酸使用—探針技術(shù)、雜交技術(shù)、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)構(gòu)建基因組文庫，初始DNA長度須在90kb以上。純化的mRNA在70%的乙醇中可保存1年以上。絕大多數(shù)Ⅱ類限制酶識別長度為4或6個(gè)核苷酸?！?在酶切圖譜制作過程中,分離鑒定和純化DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)方法聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）、瓊脂糖凝膠電泳。普通水平電泳制備染色體DNA酶切圖譜時(shí)，DNA電泳遷移率的對數(shù)與凝膠濃度成線性關(guān)系，分離＜ %%，分離＞10kb %%，在低電壓時(shí)，線狀DNA片段的遷移率與所加電壓成正比，電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使＞2kb DNA片段的分辯率達(dá)到最大，所加電壓不得超過5V/cm。細(xì)菌的培養(yǎng)技術(shù)一、培養(yǎng)基：營養(yǎng)物質(zhì)：蛋白胨、肉浸汁和牛肉膏、糖醇類、血液、動物血清與雞蛋、無機(jī)鹽類、生長因子。二、水分。三、凝固物：瓊脂、明膠、卵蛋白及血清瓊脂：成份為多糖，賦形物。固培養(yǎng)基2—3%，—%明膠:主含蛋白質(zhì),24℃以上溶解,20℃以下凝固四、抑制劑：五、指示劑：酚紅、溴甲酚紫、中性紅、甲基紅、溴香草酚藍(lán)、中國藍(lán)、酸性復(fù)紅等酸堿指示劑；美藍(lán)氧化還原指示劑