【文章內(nèi)容簡介】 一次，冷卻后再劃下一區(qū)域，每一區(qū)域的劃線均接觸上一區(qū)域的接種線 1―2 次，使菌量逐漸減少以獲得單個菌落。 快速劃線分離法：采用快速劃線使一接種環(huán)標(biāo)本能分離出單個菌落，這與標(biāo)本的菌量及操作者的技能有很大關(guān)系。 ，所用平板大小可根據(jù)需要的菌量而定。方法是將一單個菌落或?qū)⑾嗤木渥鞔罅棵芗縿澯谄桨迳隙@得大量純的培養(yǎng)物。 作業(yè)指導(dǎo)書 顯微鏡檢查 法 文件編號： LAB－ SOP－ JX022 顯微鏡檢查法 顯微鏡檢查是細(xì)菌鑒定工作中的一重要手段，有助于細(xì)菌的初步鑒別，同時對下一步鑒定工作起著重要的指導(dǎo)作用。有時通過形態(tài)學(xué)檢查可得到初步診斷，如痰中的抗酸桿菌和泌尿生殖道分泌物中的淋病奈瑟菌等。顯微鏡檢查有不染色標(biāo)本檢查法和染色標(biāo)本檢查法兩種。 1. 不染色標(biāo)本的檢查：不染色標(biāo)本主要用于檢查細(xì)菌的動力及運(yùn)動狀況。 壓滴法：用接種環(huán)取細(xì)菌懸液 2 環(huán)，置于清潔載玻片中央，覆上蓋玻片，于高倍鏡下觀察。制片時菌液要適量，不可有氣泡，不可外溢。 懸滴法： 取潔凈的凹窩載玻片及蓋玻片各 1 塊，將凹孔四周的平面上涂上一層凡士林，取一環(huán)菌液置蓋玻片中央，將凹窩載玻片的凹面向下，對準(zhǔn)于蓋玻片的液滴上，然后迅速翻轉(zhuǎn)玻片，用小鑷子輕壓蓋玻片使之與凹孔邊緣粘緊。鏡下觀察時先低倍后高倍，不可壓碎蓋玻片。有動力的細(xì)菌可見細(xì)菌從一處移到另一處，無動力的細(xì)菌呈布朗運(yùn)動而無位置的改變。螺旋體由于菌體纖細(xì)、透明，需用暗視野顯微鏡觀察其形態(tài)、活動。 2. 染色標(biāo)本檢查法：通過對標(biāo)本的制片及染色，能觀察細(xì)菌的形態(tài)、大小、排列、染色特性以及莢膜、芽胞、異染顆粒等結(jié)構(gòu)，有助于細(xì)菌的初步鑒定。 快速革蘭染色法 結(jié)果：革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。 注意事項：染色關(guān)健在于涂片和脫色，涂片不宜過厚，固定不宜過熱，脫色不宜過度，菌齡為 18～ 24 小時為佳。 抗酸染色法 操作見試劑說明書 結(jié)果：抗酸桿菌呈紅色。 注意事項：每一張玻片只能涂一份標(biāo)本且不能在染色缸中染色，以免造成不同標(biāo)本間的交互污染從而導(dǎo)致陰陽性結(jié)果混淆，脫色時間寧長勿短，至無紅色液體流下為止。 阿爾培異染顆粒染色法： 初染：涂片上滴加第一液染劑（甲苯胺藍(lán) 和孔雀綠的乙醇溶液），染 35 分鐘，水洗。 復(fù)染：第二液染劑（碘化鉀溶液）染 1 分鐘，水洗。自然干燥后鏡檢。 結(jié)果：菌體呈綠色，異染顆粒呈藍(lán)黑色。 注意事項：玻片要清潔，染料需新鮮配制，無沉淀物。注意與標(biāo)本中的其他雜質(zhì)相區(qū)別。 ，主要觀察細(xì)菌在組織中的分布。 ：背景著色而菌體不著色的染色法，用以觀察新型隱球菌的寬厚莢膜等。 ，觀察細(xì)菌有否鞭毛、鞭毛的位置、鞭毛的數(shù)量，在非發(fā)酵菌的鑒定中是一項重要的指標(biāo)。 ：觀察一些較微小且 有一定結(jié)構(gòu)的微生物，如鉤端螺旋體的鉤狀及螺旋的形態(tài)等。 ，在標(biāo)本加入抗血清，觀察動力是否被抑制，如霍亂弧菌的制動試驗等。 ，用標(biāo)有熒光素的物質(zhì)與檢材中的微生物特異結(jié)合產(chǎn)生熒光的特點(diǎn)而對微生物作出鑒定。 作業(yè)指導(dǎo)書 穿刺液標(biāo)本的 細(xì)菌學(xué)檢驗 文件編號： LAB－ SOP－ JX023 穿刺液標(biāo)本的細(xì)菌學(xué)檢驗 1. 標(biāo)本采集 穿刺液包括胸水、腹水、心包液、關(guān)節(jié)液及鞘膜液等。 一般由臨床醫(yī)師以無菌操作穿刺術(shù)抽取。胸腹水抽取 5～ 10 毫升，心包液、關(guān)節(jié)液等可抽取 2～ 5m1，將所取得之樣本注入含有抗凝劑的無菌管內(nèi)充分混勻后送檢。 標(biāo)本采集最好能在停藥 2 天后進(jìn)行，如不能停藥，則應(yīng)在下次用藥前采集，如疑為淋病性關(guān)節(jié)炎患者，其標(biāo)本應(yīng)在采集后立即送檢或床邊直接接種，切不可放冰箱保存。 2. 檢驗步驟 涂片檢查 標(biāo)本 3000r/min 離心 l5 分鐘后，取沉淀物制片。 涂片鏡檢的細(xì)菌常為一般致病菌、革蘭氏陰性雙球菌和抗酸桿菌等，涂片檢查應(yīng)根據(jù)項目要求進(jìn)行相應(yīng)的染色鏡檢。 培養(yǎng)：作一般細(xì)菌培養(yǎng)可把采集的標(biāo)本接種于血平板、麥康凱、巧克力平板，同時也可將標(biāo) 本注入血培養(yǎng)瓶放入血培養(yǎng)儀培養(yǎng)。 作厭氧培養(yǎng)可采用直接床邊接種標(biāo)本或采集樣本后，將培養(yǎng)物直接注入?yún)捬踉鼍囵B(yǎng)基。 3. 操作流程 穿刺液 厭氧 涂片革蘭氏染色 需氧 注入血培養(yǎng)瓶 厭氧平板 血平板 放入血培養(yǎng)儀 厭氧肉湯 初步報告 麥康凱 陽性報警 巧克力 分離培養(yǎng) 菌落觀察 涂片染色 Vitek32 鑒定、藥敏 /BD 鳳凰鑒定、藥敏 確定報告 4. 報告結(jié)果 涂片報告發(fā)現(xiàn)形似某某細(xì)菌，淋球菌應(yīng)報是否在細(xì)胞內(nèi)外發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性雙球菌；抗酸染色應(yīng)報是否發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌。 用于培養(yǎng)的穿刺液 正常情況下應(yīng)無菌，如培養(yǎng)出細(xì)菌應(yīng)報細(xì)菌種名及藥敏試驗結(jié)果，血培養(yǎng)儀培養(yǎng) 6 天仍未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌則報無菌生長。 檢驗科 作業(yè)指導(dǎo)書 膽汁標(biāo)本的細(xì)菌學(xué)檢驗 文件編號： LAB－ SOP－ JX024 膽汁標(biāo)本的細(xì)菌學(xué)檢驗 膽汁培養(yǎng)常見病原菌 革蘭陽性菌 革蘭陰性菌 腸球菌 大腸埃希菌 葡萄球菌 變形桿菌消化鏈球菌 肺炎克雷伯氏菌產(chǎn)氣腸桿菌銅綠假單胞菌傷寒及其它沙門菌擬桿菌糞產(chǎn)鹼桿菌 膽汁標(biāo)本的采集方法有三種，即十二指腸引流法，膽囊穿刺法及手術(shù)直接采取法。 十二指腸引流法：在無菌操作下用導(dǎo) 管作十二指腸引流膽汁，分為 A、 B、 C 三部分。 A液來自膽管，為橙黃或金黃； B 液來自膽囊，為棕黃綠色； C 液來自肝膽道，為檸檬色。一般認(rèn)為 B 液做細(xì)菌培養(yǎng)意義較大。 膽囊穿刺法：進(jìn)行膽囊造影時同時采取膽汁。本法所采取的膽汁不易被污染，適宜做細(xì)菌培養(yǎng)。 手術(shù)采取法：在進(jìn)行膽部外科手術(shù)時直接采取膽汁送檢。 將送檢標(biāo)本 3000r/min 離心 30 分鐘，傾去上清液 取沉淀物涂片及培養(yǎng)。 膽汁一般不作涂片檢驗，如需要應(yīng)用相應(yīng)的染色方法檢查并仔細(xì)觀察，因為膽汁沉淀后有較多的內(nèi)容物復(fù)蓋而不利于觀察細(xì)菌。 培養(yǎng)提倡直接將膽汁注入血培養(yǎng)瓶進(jìn)行增菌培養(yǎng)。培養(yǎng)標(biāo)本也可直接種血平板、麥康凱平板和巧克力平板。 膽汁 需氧 血培養(yǎng)瓶增菌 涂片染色 血平板、巧克力平板 血平板、巧克力平板 初步報告 麥康凱 菌落觀察 涂片染色 Vitek32 鑒定、藥敏 /BD 鳳凰鑒定、藥敏 確定報告 檢驗科 作業(yè)指導(dǎo)書 膽汁標(biāo)本的細(xì)菌學(xué)檢驗 文件編號： LAB－ OP－ XJ024 沙門氏菌感染在膽汁中檢出率較高，但必須以血清凝集試驗為依據(jù)報告血清型。 膽汁應(yīng)是無菌的，如培養(yǎng)出細(xì)菌即為致病菌應(yīng)報細(xì)菌的種屬及藥敏試驗結(jié)果。檢驗科 作業(yè)指導(dǎo)書 糞便標(biāo)本的細(xì)菌學(xué)檢驗 文件編號： LAB－ SOP－ JX025 糞便標(biāo)本的細(xì)菌學(xué)檢驗 革蘭陽性菌 革蘭陰性菌 金黃色葡萄球菌 傷寒及其它沙門菌 結(jié)核分支桿菌 志賀菌屬 難辨梭菌 致病大腸埃希菌 白色念珠菌 （ ETEC、 EPEC、 EIEC、 EHEC） 弧菌屬菌種 氣單胞、鄰單胞菌種 小腸結(jié)腸炎耶爾森 菌 彎曲菌 自然排便采集法 自然排便后，挑取膿血、粘膜部分的糞便 2～ 3g，液體糞便取絮狀物置于大便培養(yǎng)管或增菌液中送檢。 直腸肛管法 用大便培養(yǎng)用的肛管直接插入肛門成人 4～ 5cm，幼兒 2～ 3cm，輕輕在直腸內(nèi)旋轉(zhuǎn)數(shù)次，目的是使直腸表面粘液能通過肛管孔進(jìn)入肛管內(nèi)。然后拔出放入大便培養(yǎng)管中送檢。 涂片檢查 糞便標(biāo)本因各種正常菌群含量甚多而一般不作直接涂片找致病菌，只有懷疑霍亂弧菌及菌群失調(diào)所致腹瀉時，才作直接涂片檢查。 各項的涂片檢驗均按染色方法進(jìn)行， 但大便檢查霍亂弧菌有其處理程序： 染色檢查：將米泔樣的標(biāo)本涂 2 張片用乙醇固定后染色，目的觀察弧菌有無呈魚群狀排列。 懸滴檢查 取患者糞便制成懸滴涂片，霍亂弧菌和 EI tor 弧菌均呈現(xiàn)極活潑的穿梭狀運(yùn)動。 制動檢驗 運(yùn)動活潑的弧菌涂片加人霍亂弧菌診斷血清后，在顯微鏡下觀察，若原運(yùn)動活潑的現(xiàn)象停止，為制動試驗陽性。 大便標(biāo)本的培養(yǎng)目的是培養(yǎng)致病菌或追蹤病人有否菌群失調(diào)現(xiàn)象，無特殊要求作一般致病菌培養(yǎng)的標(biāo)本接種麥康凱、 SS 平板各一個。 菌群失調(diào)的細(xì)菌學(xué)檢驗：選用多種培養(yǎng) 基包括 SS、麥康凱、血平板、高鹽甘露醇鹽瓊脂平板、 CampyBA 血瓊脂平板和沙氏瓊脂等，目的是使更多的菌群得到生長，以利于檢查腸道的細(xì)菌情況。 霍亂弧菌的培養(yǎng)，直接取患者米泔樣糞便 ，接種于堿性蛋白胨水增菌液和 4 號平板， 35℃ 培養(yǎng) 6～ 8h，再轉(zhuǎn)種一只 4 號平板。 35℃ 培養(yǎng) 18～ 24h 后形成較大、菌落中間為灰黑色、有光澤、隆起、濕潤的菌落，如潑水狀。挑取可疑菌落 5～ 10 個與霍亂多價 “O” 診斷血清作玻片凝集試驗，如為陽性，則立即報告，并將可疑菌送成都市疾病控制中心確認(rèn)。 作結(jié)核菌培養(yǎng)應(yīng)先處理 (參照雜菌處理方法篇章介紹 )后種入改良羅氏培養(yǎng)基中或 magot培養(yǎng)基。 厭氧性難辨梭菌的培養(yǎng)參照厭氧培養(yǎng)。 真菌培養(yǎng)：真菌性腹瀉多繼發(fā)于抗生素治療后，常見的真菌腹瀉多由白色假絲酵母菌引起。將標(biāo)本接種于沙氏平板及血平板上，置 27℃ 和 35℃ 培養(yǎng) 18～ 24h，根據(jù)形態(tài)染色、菌落特征或采用 VITEK32 YBC 或 API Aux 半自動條鑒定，并做 ATB Fungus 藥敏試驗。 作業(yè)指導(dǎo)書 糞便標(biāo)本的細(xì)菌學(xué)檢驗 文件編號： LAB－ SOP－ JX025 糞便或肛拭子 增菌培養(yǎng) 分離培養(yǎng) 涂片檢查 沙門氏菌、志賀氏菌 35℃18 ～ 24h 霍亂弧菌 SS、麥康凱平板 革蘭氏染色 觀察動力 沙氏斜面、 血平板等 菌落觀察 涂片檢查 血清學(xué)鑒定 Vitek32 鑒定、藥敏 /BD 鳳凰鑒定、藥敏 確定報告 ：查出腸道致病菌，報告其菌名和藥敏結(jié)果。如為致病性大腸埃希菌必須以血清學(xué)診斷試驗為鑒定依據(jù)，報告應(yīng)包括 ETEC、 EPEC、 EIEC、 EHEC。 、沙門氏菌、志賀氏菌、致病性大腸桿菌時應(yīng)作為危急值報告，并填寫幾危急值報告單。 作業(yè)指導(dǎo)書 血液及骨 髓標(biāo)本 的細(xì)菌學(xué)檢驗 文件編號： LAB－ SOP－ JX026 血液及骨髓標(biāo)本的細(xì)菌學(xué)檢驗 血液及骨髓標(biāo)本中常見病原菌 革蘭陽性菌 革蘭陰性菌 肺炎鏈球菌 大腸埃希菌 金黃色葡萄球菌 傷寒及其它沙門菌 表皮葡萄球菌 變形桿菌 溶血性鏈球菌 產(chǎn)氣腸桿菌 糞腸球菌 肺炎克雷伯氏菌 銅綠假單胞菌 糞產(chǎn)鹼桿菌 沙雷氏菌 流感嗜血桿菌 布魯氏菌 采血時間：在病人發(fā)熱初期 12 天內(nèi)或發(fā)熱高峰時采集血液標(biāo)本。采血時間原則上應(yīng)選擇在抗菌藥物應(yīng)用前 ,對已用藥而又不能中止用藥的病人，應(yīng)在下次 用藥前采集。 標(biāo)本采集方法及標(biāo)本量 成人每次采血 10ml，嬰幼兒每次采血 15ml。嚴(yán)格無菌采集的血液標(biāo)本應(yīng)立即加入血培養(yǎng)瓶內(nèi)，迅速輕搖，使之充分混合，以防血液凝固。對于疑為細(xì)菌性骨髓炎病人，應(yīng)在嚴(yán)格消毒后抽取骨髓 1ml 然后注入小兒瓶中進(jìn)行增菌培養(yǎng)。 血液 無菌注入 血培養(yǎng)瓶 6 天無菌生長 增菌培養(yǎng) 血平板 陽性報警 巧克力平板 無菌生長 發(fā)陰性報告 涂片染色 血平板 初步報告 巧克力平板（ 5%CO2 條件） 3537℃ ， 1824 小時 菌落觀察、涂片染色及相關(guān)酶試驗 Vitek32 鑒定、藥敏 /BD 鳳凰鑒定、藥敏 確定報告 作業(yè)指導(dǎo)書 血液及骨髓標(biāo)本 的細(xì)菌學(xué)檢驗 文件編號： LAB－ OP－ XJ026 4. 報告結(jié)果 在血液中檢出沙門氏菌，必須以血清凝集試驗為依據(jù)報告血清型。 血液正常情況下應(yīng)是無菌的，如培養(yǎng)出細(xì)菌即為致病菌，應(yīng)報細(xì)菌的種屬及藥敏試驗結(jié)果。 血培養(yǎng)陽性均作為危急值報告，并填寫危急值報告單。 作業(yè)指導(dǎo)書 腦脊液的細(xì)菌學(xué)檢驗 文件編號： LAB－ OP－ XJ027 腦脊液的細(xì)菌學(xué)檢驗 腦脊液培養(yǎng)常見病原菌 革蘭陽性菌 革蘭陰性菌 金黃色葡萄球菌 腦膜炎奈瑟菌 A、 B 群鏈球菌 卡他布蘭漢菌 肺炎鏈球菌 流感嗜血桿菌 結(jié)核分支桿菌 腸桿菌科菌種 產(chǎn)單核李斯特菌 腦膜敗血性黃桿菌 新型隱球菌 假單胞菌 白色念珠菌 ： 標(biāo)本必須由臨床醫(yī)師以無菌操作收集腦脊液 3～ 5ml，盛于無菌管中送檢。腦脊液中某些細(xì)菌（腦膜炎奈瑟菌、肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌等）易死亡，故收集標(biāo)本后應(yīng)立即送檢。切不可低溫（冰箱）保存。 ： 一般細(xì)菌涂片檢查 除結(jié)核性腦膜炎外，由其它細(xì)菌引起的化膿性腦膜炎，腦脊液明顯混濁，可直接涂片，革蘭染色鏡檢。無色 透明的腦脊液，應(yīng)離心后涂片、染色、鏡檢，根據(jù)