【文章內(nèi)容簡介】 、 設備和材料 ：顯微鏡、手提高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、培養(yǎng)皿、 500ml三角瓶、接種針、小籠格、噴槍、小刀、帶蓋廣口玻璃瓶、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (PDA)、無菌水、廢物缸 等。 溶液或試劑： pH 值試紙（ 1～ 14）。 菌種和培養(yǎng)料：毛霉斜面菌種、豆腐坯、紅曲米、面曲、甜酒釀、白酒、黃酒、食鹽。 四 、 實驗原理 豆腐乳是我國獨特的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，是用豆腐發(fā)酵制成。民間老法生產(chǎn)豆腐乳均為自然發(fā)酵，現(xiàn)代釀造廠多采用蛋白酶活性高的魯氏毛霉或根霉發(fā)酵。豆腐坯上接種毛霉，經(jīng)過培養(yǎng)繁殖，分泌蛋白酶、淀粉酶、谷氨酰胺酶等復雜酶系，在長時間的發(fā)酵中與腌坯調(diào)料中的酶系、酵母、細菌等協(xié)同作用，使腐乳坯蛋白質(zhì)緩慢水解，生成多種氨基酸，加之由微生物代謝產(chǎn)生的各種有機酸與醇類作用生成酯，形成細膩、鮮 香的豆腐乳特色。 五、實驗流程與步驟 實驗流程 ⑴ 毛霉斜面菌 種→ 擴大培養(yǎng)→孢子懸浮液 ↓ 豆腐→豆腐坯→接種→培養(yǎng)→晾花→加鹽→腌坯→裝瓶→后熟→成品 ⑵ 毛霉的分離 配制培養(yǎng)基→毛霉分離→觀察菌落→顯微鏡檢 ⑶ 豆腐乳的制備 懸液制備→接種孢子→培養(yǎng)與晾花→裝瓶與壓坯→裝壇發(fā)酵→感官鑒定 實驗步驟 ⑴ 毛霉的分離 ① 配制培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (PDA)，經(jīng)配制、滅菌后倒平板備用。 ② 毛霉的分離：從長滿毛霉菌絲的豆腐坯上取小塊于 5ml 無菌水中，振搖，制成孢子懸液，用接種 環(huán)取該孢子懸液在 PDA 平板表面作劃線分離，于 20℃培養(yǎng) 1～2d，以獲取單菌落。 ③ 初步鑒定 Ⅰ： 菌落觀察：呈白色棉絮狀，菌絲發(fā)達。 Ⅱ： 顯微鏡檢 ： 于載玻片上加 1滴石炭酸液，用解剖針從菌落邊緣挑取少量菌絲于載玻片上，輕輕將菌絲體分開，加蓋玻片，于顯微鏡下觀察孢子囊、梗的著生 15 情況。若無假根和匍匐菌絲或菌絲不發(fā)達，孢囊梗直接由菌絲長出，單生或分枝，則可初步確定為毛霉。 ⑵ 豆腐乳的制備 ①懸液制備 Ⅰ：毛霉菌種的擴繁：將毛霉菌種接入斜面培養(yǎng)基，于 25℃培養(yǎng) 2d；將斜面菌種轉(zhuǎn)接到盛有種子培養(yǎng)基的三角瓶中，于 同樣溫度下培養(yǎng)至菌絲和孢子生長旺盛，備用。 Ⅱ：孢子懸液制備：于上述三角瓶中加入無菌水 200ml，用玻璃棒攪碎菌絲，用無菌雙層紗布過濾，濾渣倒回三角瓶，再加 200ml無菌水洗滌 1次，合并濾液于第一次濾液中，裝入噴槍貯液瓶中供接種使用。 ②接種孢子：用刀將豆腐坯劃成 的塊，將籠格經(jīng)蒸汽消毒、冷卻，用孢子懸液噴灑籠格內(nèi)壁，然后把劃塊的豆腐坯均勻豎放在籠格內(nèi)，塊與塊之間間隔 2cm。再用噴槍向豆腐塊上噴灑孢子懸液，使每塊豆腐周身沾上孢子懸液。 ③培養(yǎng)與晾花：將放有接種豆腐坯的籠格放入 培養(yǎng)箱中，于 20℃左右下培養(yǎng)，培養(yǎng) 20h 后，每隔 6h 上下層調(diào)換一次，以更換新鮮空氣，并觀察毛霉生長情況。44～ 48h 后，菌絲頂端已長出孢子囊，腐乳坯上毛霉呈棉花絮狀，菌絲下垂，白色菌絲已包圍住豆腐坯，此時將籠格取出，使熱量和水分散失，坯迅速冷卻，其目的是增加酶的作用，并使霉味散發(fā)，此操作在工藝上稱為晾花。 ④裝瓶與壓坯：將冷至 20℃以下的坯塊上互相依連的菌絲分開，用手指輕輕在每塊表面揩涂一遍，使豆腐坯上形成一層皮衣，裝入玻璃瓶內(nèi)，邊揩涂邊沿瓶壁呈同心圓方式一層一層向內(nèi)側(cè)放，擺滿一層稍用手壓平，撒一層食鹽，每 100 塊豆腐坯用鹽約 400g，使平均含鹽量約為 16％，如此一層層鋪滿瓶。下層食鹽用量少，向上食鹽逐層增多，腌制中鹽分滲入毛坯，水分析出，為使上下層含鹽均勻，腌坯3～ 4d 時需加鹽水淹沒坯面，稱之為壓坯。腌坯周期冬季 13d，夏季 8d。 ⑤裝壇發(fā)酵 Ⅰ：紅方：按每 100 塊坯用紅曲米 32g、面曲 28g、甜酒釀 1kg 的比例配制染坯紅曲鹵和裝瓶紅曲鹵。先用 200g 甜酒釀浸泡紅曲米和面曲 2d，研磨細，再加 200g甜酒釀調(diào)勻即為染坯紅曲鹵。將腌坯瀝干，待坯塊稍有收縮后，放在染坯紅曲鹵內(nèi)，六面染紅，裝入經(jīng)預先消毒的玻瓶中。再 將剩余的紅曲鹵用剩余的 600g 甜酒釀兌稀，灌入瓶內(nèi)，淹沒腐乳，并加適量面鹽和 50 度白酒，加蓋密封，在常溫下貯藏 6個月成熟。 Ⅱ：白方：將腌坯瀝干，待坯塊稍有收縮后，將按甜酒釀 kg、黃酒 1 kg、白酒 、鹽 的配方配制的湯料注入瓶中，淹沒腐乳，加蓋密封，在常溫下貯藏 2～ 4個月成熟。 ⑥質(zhì)量鑒定 將成熟的腐乳開瓶，進行感官質(zhì)量鑒定、評價。 六、 實驗 注意事項 將放有接種豆腐坯的籠格放入培養(yǎng)箱中，于 20℃左右下培養(yǎng)，培養(yǎng) 20h 后，每隔 6h上下層調(diào)換一次，以更換新鮮空氣。 在顯微鏡 下鑒定毛霉：注意觀察孢子囊、梗的著生情況，若無假根和匍匐菌絲或菌絲不發(fā)達，孢囊梗直接由菌絲長出，單生或分枝，則可初步確定為毛霉。 注意 壓坯：為使上下層含鹽均勻，腌坯 3～ 4d 時需加鹽水淹沒坯面。 注意無菌操作。 16 七、實驗作業(yè)與思考題 實驗作業(yè) ⑴ 從腐乳的表面及斷面色澤、組織形態(tài) (塊形、質(zhì)地 )、滋味及氣味、有無雜質(zhì)等方面綜合評價腐乳質(zhì)量。 實驗思考題 ⑴腐乳生產(chǎn)主要采用何種微生物 ? ⑵腐乳生產(chǎn)發(fā)酵原理是什么 ? ⑶試分析腌坯時所用食鹽含量對腐乳質(zhì)量有何影響 ? 17 實驗 六 醬油種曲孢子數(shù)及發(fā)芽率的測定 一 、 目的和要求 掌握應用血球計數(shù)板測定孢子數(shù)方法。 學習孢子發(fā)芽率的測定方法。 二 、 實驗內(nèi)容 醬油種曲孢子數(shù)測定法 孢子發(fā)芽率測定法 三 、 儀器 、 設備和材料 ：電子天平、顯微鏡、手提高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、培養(yǎng)皿、蓋玻片、旋渦均勻器、血球計數(shù)板、廢物缸等。 ： 95％酒精、稀硫酸 (1： 10)、 pH 值試紙（ 114）。 : 醬油種曲。 四 、 實驗原理 醬油種曲孢子數(shù) 測定法 種曲是成曲的曲種，是保 證成曲的關鍵，是釀制優(yōu)質(zhì)醬油的基礎。種曲質(zhì)量要求之一是含有足夠的孢子數(shù)量，必須達到 6 109／ g(干基計 )以上，孢子旺盛、活力強、發(fā)芽率達 85％以上，所以孢子數(shù)及其發(fā)芽率的測定是種曲質(zhì)量控制的重要手段。測定孢子數(shù)方法有多種，本實驗采用血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)，這是一種常用的細胞計數(shù)方法。此法是將孢子懸浮液放在血球計數(shù)板與蓋片之間的計數(shù)室中，在顯微鏡下進行計數(shù)。由于計數(shù)室中的容積是一定的，所以可以根據(jù)在顯微鏡下觀察到的孢子數(shù)目來計算單位體積的孢子總數(shù)。 實驗中，稱樣時要盡量防止孢子的飛揚。測定時，如果發(fā)現(xiàn) 有許多孢子集結(jié)成團或成堆，說明樣品稀釋未能符合操作要求，因此必須重新稱重、振搖、稀釋。生產(chǎn)實踐中應用時，種曲通常以干物質(zhì)計算。 種曲孢子發(fā)芽率的測定 測定孢子發(fā)芽率的方法常有液體培養(yǎng)法和玻片培養(yǎng)法，部頒標準采用玻片培養(yǎng)法。本實驗應用液體培養(yǎng)法制片在顯微鏡下直接觀察測定孢子發(fā)芽率。孢子發(fā)芽率除受孢子本身活力影響外，培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)溫度、通氣狀況等因素也會直接影響到測定的結(jié)果。所以測定孢子發(fā)芽率時，要求選用固定的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，才能準確反映其真實活力。 五、實驗流程與步驟 實驗流程 ①醬油種曲孢子數(shù) 測 定 法 曲種→稱量→稀釋→過濾→定容→制計數(shù)板→觀察計數(shù)→計算 ②種曲孢子發(fā)芽率的測定方法 種曲孢子粉→接種→恒溫培養(yǎng)→制標本片→鏡檢→計數(shù) 實驗步驟 ㈠醬油種曲孢子數(shù) 測定法 ⑴ 樣品稀釋：精確稱取種曲 1g(稱準至 )，倒入盛有玻璃珠的 250ml 三角瓶內(nèi)，加入 95％酒精 5ml、無菌水 20ml、稀硫酸 (1:l0)l0ml，在旋渦均勻器上充分振搖，使種曲孢子分散，然后用 3層紗布過濾，用無菌水反復沖洗，務使濾渣不 18 含孢子，最后稀釋至 500ml。 ⑵制計數(shù)板：取潔凈干燥的血球計數(shù)板蓋上蓋玻片，用無菌滴管取 孢子稀釋液1 小滴，滴于蓋玻片的邊緣處 (不宜過多 )，讓滴液自行滲入計數(shù)室中，注意不可有氣泡產(chǎn)生。若有多余液滴，可用吸水紙吸干，靜止 5min，待孢子沉降。 ⑶觀察計數(shù) ①觀察：用低倍鏡頭和高倍鏡頭觀察，由于稀釋液中的孢子在血球計數(shù)板上處于不同的空間位置，要在不同的焦距下才能看到，因而計數(shù)時必須逐格調(diào)動微調(diào)螺旋，才能不使之遺漏，如孢子位于格的線上，數(shù)上線不數(shù)下線，數(shù)左線不數(shù)右線。 ②計數(shù)：使用 16～ 25規(guī)格的計數(shù)板時，只計板上 4個角上的 4個中格 (即 100個小格 )，如果使用 25～ 16 規(guī)格的計數(shù)板，除計 4 個角上的 4 個中格外，還需要計中央一個中格的數(shù)目 (即 80 個小格 )。每個樣品重復觀察計數(shù)不少于 2 次，然后取其平均值 ⑷計算 ① 16 25 的計數(shù)板 孢子數(shù) (1／ g)＝ (N／ 100) 400X10 000 (V／ G)＝ 4X104 (NV／ G) （ 式中： N為 100 小格內(nèi)孢子總數(shù)； V 為孢子稀釋液體， ml； G為樣品質(zhì)量， g） ② 25 16 的計數(shù)板 孢子數(shù) (1／ g)＝ (N／ 80) 400 10 000 (V／ G)＝ 5X104 (NV／ G) （ 式中： N為 80 小格內(nèi)孢子總數(shù)； V為孢子稀釋液體積， ml； G為樣品質(zhì)量， g） ㈡種曲孢子發(fā)芽 率的測定方法 ⑴接種：用接種環(huán)挑取種曲少許接入含察氏液體培養(yǎng)基的三角瓶中，置于 30℃下?lián)u床振蕩恒溫培養(yǎng) 3～ 5h。 ⑵制片：用無菌滴管取上述培養(yǎng)液于載玻片上滴一滴，蓋上蓋玻片，注意不可產(chǎn)生氣泡。 ⑶鏡檢：將標本片直接放在高倍鏡下觀察發(fā)芽情況，標本片至少同時做 2個，連續(xù)觀察 2次以上，取平均值，每次觀察不少于 100 個孢子發(fā)芽情況。 ⑷計算 發(fā)芽率＝ A／ (A+B) 100％ （式中： A為發(fā)芽孢子數(shù)； B為未發(fā)芽孢子數(shù)） 六、 實驗 注意事項 醬油種曲孢子數(shù) 測定 采用血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)測定時，如果發(fā)現(xiàn)有許多孢子 集結(jié)成團或成堆，說明樣品稀釋未能符合操作要求，因此必須重新稱重、振搖、稀釋。生產(chǎn)實踐中應用時，種曲通常以干物質(zhì)計算。 醬油種曲孢子數(shù) 測定 制計數(shù)板時，滴于蓋玻片的邊緣處 (不宜過多 )，讓滴液自行滲入計數(shù)室中，注意不可有氣泡產(chǎn)生。若有多余液滴，可用吸水紙吸干，靜止 5min，待孢子沉降。 應用液體培養(yǎng)法制片在顯微鏡下直接觀察測定孢子發(fā)芽率，培養(yǎng)前要檢查調(diào)整孢子接入量，以每個視野含孢子數(shù) 10～ 20 個為宜。 孢子發(fā)芽率除受孢子本身活力影響外，培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)溫度、通氣狀況等因素也會直接影響到測定的結(jié)果。所以 測定孢子發(fā)芽率時，要求選用固定的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，才能準確反映其真實活力。 種曲孢子發(fā)芽率的測定制片 時， 用無菌滴管取上述培養(yǎng)液于載玻片上滴一滴，蓋上蓋玻片，注意不可產(chǎn)生氣泡。 注意無菌操作。 19 七、實驗作業(yè)與思考題 實驗作業(yè) ⑴ 樣品稀釋至每個小格所含孢子數(shù)在 10 個以內(nèi)較適宜，過多不易計數(shù)，應進行稀釋調(diào)整。結(jié)果記入表。 ⑵ 正確區(qū)分孢子的發(fā)芽和不發(fā)芽狀態(tài)。 結(jié)果記入表。 實驗思考題 ⑴ 用血球計數(shù)板測定孢子數(shù)有什么優(yōu)缺點 ? ⑵ 影響孢子發(fā)芽率的因素有哪些 ?哪些實驗步驟容易造成結(jié)果誤差 ? 20 實驗 七 大分子物質(zhì)的水解試驗 一 、 目的和要求 證明不同微生物有著不同的酶系，且對各種有機大分子的水解能力不同。 二 、 實驗內(nèi)容 證明不同微生物對各種有機大分子的水解能力不同，從而說明不同微生物有著不同酶系統(tǒng)。 掌握進行微生物大分子水解試驗的原理和方法。 三 、 儀器 、 設備和材料 儀器或其他用具：凈化工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、無菌平板、無菌試管、無菌水、接種環(huán)、接種針、鑷子、酒精燈、火柴、玻棒、試管架、記號筆、牛皮紙、棉繩、廢物缸。滅菌玻璃涂棒，滅菌吸管等。 溶液 或試劑：革蘭氏染色用盧戈氏碘液 菌種： 枯草芽胞桿菌，大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，普通變形桿菌 (Proteus vularis)。 培養(yǎng)基：固體油脂培養(yǎng)基，固體淀粉培養(yǎng)基，明膠培養(yǎng)基試管，石蕊牛奶試管 培養(yǎng)基 ，尿素瓊脂試管 培養(yǎng)基 。 四 、 實驗原理 微生物對大分子的淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪不能直接利用，必須靠產(chǎn)生的胞外酶將大分子物質(zhì)分解才能被微生物吸收利用。胞外酶主要為水解酶，通過加水裂解大的物質(zhì)為較小的化合物，使其能被運輸至細胞內(nèi)。如淀粉酶水解淀粉為小 分子的糊精、雙糖和單糖；脂肪酶水解脂肪為甘油和脂肪酸；蛋白酶水解蛋白質(zhì)為氨基酸等。這些過程均可通過觀察細菌菌落周圍的物質(zhì)變化來證實：淀粉遇碘液會產(chǎn)生藍色，但細菌水解淀粉的區(qū)域，用碘測定不再產(chǎn)生藍色，表明細菌產(chǎn)生淀粉酶。脂肪水解后產(chǎn)生脂肪酸可改變培養(yǎng)基的 pH，使 pH 降低，加入培養(yǎng)基的中性紅指示劑會使培養(yǎng)基從淡紅色變?yōu)樯罴t色，說明胞外存在著脂肪酶。 微生物可以利用各種蛋白質(zhì)和氨基酸作為氮