實驗蛋白質(zhì)含量測定(編輯修改稿)
2025-06-18 01:09 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 簡便 , 迅速，靈敏度較高 。只需要一種反應(yīng)試劑 ? 影響因素較少。 去污劑 和 兩性物質(zhì) 對測定有干擾 ? 小于 3000Da 的多肽無法測定 ? 蛋白濃度高時非線性 ? 配制的染色液需過濾除去未溶解的 考馬斯亮藍(lán) G250 考馬斯亮藍(lán)染色法（ Bradford法） 生物化學(xué)與分子生物學(xué)基礎(chǔ)實驗 實驗操作步驟 室溫 放置 5分鐘后測 595nm的光吸。 考馬斯亮藍(lán)染料極易吸附于比色皿壁，每次測量后應(yīng)用 乙醇洗滌后，用雙蒸水清洗。 注意混勻，但不要劇烈震蕩。 管號 0 1 2 3 4 5 6 7 標(biāo)準(zhǔn)蛋白 ul 0 10 20 40 60 80 1 0 0 0 蒸餾水 ul 100 90 80 60 40 20 0 0 待測蛋白 ul 100 B r a d f o r d 試劑 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml A 5 9 5 考馬斯亮藍(lán)染色法（ Bradford法） 生物化學(xué)與分子生物學(xué)基礎(chǔ)實驗 原理： Folin酚試劑法的顯色試劑由 試劑甲 和 試劑乙 組成 。 試劑甲 中的 Cu2+堿性條件下與肽鍵形成絡(luò)合物并被還原成 Cu+。 Cu+以及蛋白質(zhì)中的 Tyr等的側(cè)鏈基團與 試劑乙 反應(yīng) ，試劑乙中的磷鉬酸鹽 — 磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的 Tyr和Phe殘基還原 ， 產(chǎn)生藍(lán)色化合物 （ 鉬蘭和鎢蘭的混合物 ） ， 顯色反應(yīng)在 30分鐘內(nèi)接近極限 。 顏色深淺與蛋白含量成正比 ， 可在 640nm下測光吸收 。 Folin酚試劑法（ Lowry法） 生物化學(xué)與分子生物學(xué)基礎(chǔ)實驗 ? 酸、銅離子螯合劑（如 EDTA、 檸檬酸等）、還原劑（如巰基乙醇、 DTT、 苯酚等）干擾本反應(yīng) 。 ? 不同蛋白質(zhì)主要因其所含的 Tyr含量不同而呈現(xiàn)不同的吸收強度。 ? 進(jìn)行測定時， 加試劑乙時 要特別小心，因為 該試劑僅在酸性 pH條件下穩(wěn)定 ，但上述還原反應(yīng)只在 pH=10的情況下發(fā)生，故當(dāng)試劑乙加到堿性的銅 — 蛋白質(zhì)溶液中時， 必須立即混勻 ，以便在磷鉬酸 — 磷鎢酸試劑 被破壞之前，還原反應(yīng)即能發(fā)生。 這一步混合速度要快，否則會使顯色程度減弱 。 ? 因 Lowry反應(yīng)的顯色隨時間不斷加深，因此各項操作必須精確控制時間。 ? 費時較長，試劑配制較繁瑣 。 Folin酚試劑法（ Lowry法） 生物化學(xué)與分子
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