流式細(xì)胞術(shù)的樣品制備(編輯修改稿)
2025-06-15 07:14 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 l，濃度 %，+PBS()200ml，濃度 %。 各取 40ml混合，分裝置冰箱保存，用時(shí)過(guò)濾既可。 實(shí)驗(yàn)步驟： ①將組織切成薄片放入試管。 ②加入 EDTA液 5ml，室溫，半小時(shí)，棄之。 ③加入胰酶 +EDTA液 510ml，在 37℃ 恒溫水浴 30分鐘，間斷振蕩 35次。 ④用 300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，離心沉淀 1000prm， 5分鐘，再以生理鹽水洗 23次，離心 500800prm，12分鐘。 ⑤ 70%乙醇固定置冰箱中被檢。 實(shí)驗(yàn)證實(shí)，用化學(xué)試劑處理組織導(dǎo)致細(xì)胞成活率降低，細(xì)胞產(chǎn)額較低，細(xì)胞碎片和細(xì)胞叢結(jié)的量不穩(wěn)定，因此，化學(xué)試劑處理方法不單獨(dú)使用，可與其他方法聯(lián)合使用。 機(jī)械法常常造成嚴(yán)重的細(xì)胞損傷，較低的細(xì)胞產(chǎn)量，為使細(xì)胞碎片不影響 FCM檢測(cè)結(jié)果，需采用適當(dāng)?shù)姆椒ǔニ槠虮M量減少碎片。 酶學(xué)法對(duì)實(shí)體腫瘤的分散解聚是較理想的，但是會(huì)對(duì)所測(cè)化學(xué)成分造成不良影響，所以根據(jù)使用目的去選擇合適的單細(xì)胞懸液制備方法，才能獲得理想的樣品和更好的 FCM結(jié)果。 注意事項(xiàng)： Ⅰ 新鮮組織標(biāo)本應(yīng)及時(shí)進(jìn)行保存，以免組織在室溫下放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，造成細(xì)胞自溶導(dǎo)致 DNA降解，影響 FCM測(cè)定結(jié)果。 Ⅱ 根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x用最佳的細(xì)胞固定方法，以免由于固定劑的原因，造成 FCM檢測(cè)結(jié)果的不穩(wěn)定。 Ⅲ 酶學(xué)法要注意條件的選擇和影響因素，要注意酶的溶劑，消化時(shí)間、 pH值、濃度等方面對(duì)酶消化法的影響。 Ⅳ 需注意不同的組織選用適當(dāng)?shù)姆椒?，如富于?xì)胞的腫瘤 (淋巴瘤、視神經(jīng)母細(xì)胞瘤、腦瘤、未分化癌、髓樣癌以及一些軟組織肉瘤 )不一定要用酶學(xué)或化學(xué)法，往往用單獨(dú)的機(jī)械法就可以收到大量單分散細(xì)胞。 Ⅴ 在使用酶學(xué)方法時(shí)，要重視酶的選用，如含有大量結(jié)締組織的腫瘤，如食管癌、乳癌、皮膚癌等，用膠原酶為好，因?yàn)槟z原酶具有在 Ca2＋ 、 Mg 2＋ 存在或在血清狀態(tài)下不發(fā)生活性降低的特征。 實(shí)驗(yàn)方法： ①石蠟包埋組織在切片機(jī)上切取 4050μm厚的組織片 35片。 ②將切取的組織片放入試管中。 ③加入二甲苯 58ml脫蠟 (在室溫下 )， 12天，視石蠟脫凈與否，可更換一次二甲苯，蠟脫凈后棄去二甲苯。 ④水化：依次加入 100%、 95%、 70%、 50%梯度的酒精 5ml，每步 10分鐘，去乙醇，加入蒸餾水 35ml， 10分鐘后棄之。 ⑤消化：加入 2ml %胃蛋白酶 (pH值 )置37℃ 恒溫水浴中消化 30分鐘，消化期間每隔 10分鐘振蕩一次。 石蠟包埋組織單細(xì)胞懸液的制備 ⑥ 消化 30分鐘后，立即加入生理鹽水終止消化。 ⑦經(jīng) 300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，未消化完的組織片可以二次消化。 ⑧收集細(xì)胞懸液，離心沉淀 1500prm，以生理鹽水漂洗 12次，離心沉淀 1500prm，再以生理鹽水漂洗 12次，離心沉
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