20xx年醫(yī)學(xué)專題—流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人和小鼠細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子方法的建立(編輯修改稿)
2024-11-17 22:25 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 向角（SSC）散射光散點(diǎn)圖設(shè)門區(qū)分淋巴細(xì)胞，以CD4直方圖設(shè)門區(qū)分Th細(xì)胞（CD4+），以IFNγ和IL4的散點(diǎn)圖表示Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞。結(jié)果1 不同濃度的PMA對(duì)人外周血T淋巴細(xì)胞抗原表達(dá)的影響。10ng、20ng和50ng的PMA刺激后4h，CD4的表達(dá)明顯下降，已經(jīng)不能區(qū)分出CD4陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞，而CD8和CD3的表達(dá)未受明顯影響。重復(fù)5次檢測(cè)，典型的檢測(cè)結(jié)果見圖1。2 不同時(shí)間的PMA刺激對(duì)小鼠外周血T淋巴細(xì)胞抗原表達(dá)的影響。PMA刺激8h后CD4陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞的表達(dá)沒(méi)有明顯下降。PMA刺激12h后，CD4陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞的表達(dá)明顯下降。而CD8表達(dá)在8h和12h均沒(méi)有明顯下降。典型的檢測(cè)結(jié)果見圖2。3 正常人外周血Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞。采用CD3+CD8的T淋巴細(xì)胞為Th細(xì)胞，設(shè)門分析Th1細(xì)胞（IFNγ+）和Th2細(xì)胞（IL4+）的百分比。典型檢測(cè)結(jié)果見圖3。4 正常Balb/c小鼠外周血Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞。采用CD4＋淋巴細(xì)胞為Th細(xì)胞，設(shè)門分析Th1細(xì)胞（IFNγ+）和Th2細(xì)胞的百分比（IL4+）。典型檢測(cè)結(jié)果見圖4。討論從Rostaing等[2]發(fā)表流式細(xì)胞術(shù)檢細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的方法后，陸續(xù)有人研究了流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)因子方法的可行性及重復(fù)性等問(wèn)題。雖然活化T淋巴細(xì)胞有各種各樣的方法，如：PMA、PHA、Con A、CDCD2和CD28等。但是目前公認(rèn)的較好的方法仍然是PMA和鈣離子載體的聯(lián)合刺激。研究發(fā)現(xiàn)在PMA的刺激后4h，IFNγ和IL4的表達(dá)就達(dá)到一個(gè)較高的水平，因而適合進(jìn)行流式檢測(cè)。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人的外周血T淋巴細(xì)胞表面的CD4表達(dá)受PMA的影響非常大，在刺激后2h即明顯下降，4h已經(jīng)難于區(qū)分CD4陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞，因此這就難于確定Th細(xì)胞。雖然國(guó)內(nèi)部分學(xué)者認(rèn)為在PMA的刺激下，CD4仍可以維持一定的表達(dá)[3,4]，但是我們的結(jié)果和國(guó)內(nèi)部分[5]及國(guó)外的大多數(shù)[2,6]研究結(jié)果表明，在PMA的刺激下，CD4表達(dá)迅速下調(diào)，此時(shí)采用CD4來(lái)標(biāo)記Th細(xì)胞已經(jīng)不能準(zhǔn)確的檢測(cè)Th細(xì)胞，因而不能準(zhǔn)確的反應(yīng)Th1和Th2細(xì)胞的比率。而CD3和CD8的表達(dá)受PMA等刺激因子的影響很小，因此，目前，國(guó)外推薦的方法是采用CD3和CD8設(shè)門，區(qū)分CD4陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞。由于多色熒光標(biāo)記流式檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，筆者認(rèn)為采用4色標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)人Th細(xì)胞是目前最好的方法。這種方法可以實(shí)現(xiàn)一個(gè)檢測(cè)管，同時(shí)觀察Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞；可以檢測(cè)CD8＋細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)因子的表達(dá)；還可以觀察IL4和IFNγ雙陽(yáng)性細(xì)胞。一個(gè)檢測(cè)管同時(shí)染色，節(jié)約了抗體和勞動(dòng)量等檢測(cè)成本。但是由于多色染色技術(shù)對(duì)流式的操作者有較高的要求，實(shí)施過(guò)程要注意補(bǔ)償調(diào)節(jié)等具體問(wèn)題，我們?cè)?jīng)采用CYC標(biāo)記的CD8和APC標(biāo)記的CD3聯(lián)合設(shè)門區(qū)分Th細(xì)胞，由于CYC和APC在BD公司的流式細(xì)胞儀上，儀器的補(bǔ)償調(diào)節(jié)非常困難，最終放棄該方法，改用PerCP標(biāo)記的CD8才解決這一問(wèn)題。目前，國(guó)內(nèi)一些流式細(xì)胞儀型號(hào)相對(duì)落后，不能進(jìn)行4色染色標(biāo)記技術(shù)，筆者認(rèn)為可以采用雙管標(biāo)記檢測(cè)法，即采用CDCD8和IFNγ3色標(biāo)記一管用于檢測(cè)Th1細(xì)胞；采用CDCD8和IL4 3色標(biāo)記一管用于檢測(cè)Th2細(xì)胞。采用
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