20xx年醫(yī)學專題—流式細胞儀概述(編輯修改稿)
2024-11-15 05:38 本頁面
【文章內容簡介】 （1）熒光信號線性測量和對數測量線性放大器的輸出與輸入是線性關系，細胞DNA含量、RNA含量、總蛋白質含量等的測量一般選用(xuǎny242。ng)線性放大測量。在細胞膜表面抗原等的熒光檢測時通常使用對數放大器。,第三十二頁，共七十二頁。,（2）熒光信號的面積和寬度 熒光信號的面積是采用對熒光光通量進行積分測量，一般對DNA倍體測量時采用面積，這是因為熒光脈沖的面積比熒光脈沖的高度更能準確(zhǔnqu232。)反映DNA的含量。 熒光信號的寬度常用來區(qū)分雙連體細胞。,第三十三頁，共七十二頁。,（3）光譜重疊的校正 當細胞攜帶兩種熒光受激光激發(fā)而發(fā)射兩種不同波長的熒光時，理論上可選擇(xuǎnz233。)濾片使每種熒光僅被相應的檢測器檢測，但由于目前所使用的各種熒光染料都是寬發(fā)射譜性質，雖然它們之間發(fā)射峰值各不相同，但發(fā)射譜范圍有一定的重疊。,第三十四頁，共七十二頁。,從右圖中可以看出，陰影為探測器檢測(jiǎn c232。)光譜的范圍，FITC探測器會探測到少量的PE光譜，而PE探測器則檢測到較多的FITC光譜。,第三十五頁，共七十二頁。,圖中點A通過透鏡f成像在A’處，而點B通過透鏡f成像在B’處。 在光電倍增管前放上一小孔，作為空間濾波器，排除其它雜散光信號，從而(c243。ng 233。r)確保了A點光源進不了B’點處，B點光源也進不了A’點處。,第三十六頁，共七十二頁。,（五）細胞分選器 1．小水滴的形成 壓電晶體帶動流動室振動，液流形成水滴。 噴嘴的振動頻率即每秒鐘產生水滴的數目。當噴嘴直徑(zh237。j236。ng)為50μm時，信號頻率為40kHz，則每秒鐘產生4萬個水滴。若每秒鐘流出的細胞是1000個，則平均每40個水滴中只有一個水滴是有細胞的，其他皆為空白。,第三十七頁，共七十二頁。,2．邏輯電路 為了分選細胞，需要細胞在經過測量(c232。li225。ng)區(qū)時判斷出哪個細胞滿足了分選的條件，并產生一個邏輯信號，此信號驅動充電脈沖發(fā)生器，使之產生充電脈沖。,第三十八頁，共七十二頁。,3．水滴的充電與偏轉 當水滴從流束上將要(jiāngy224。o)斷開時給整個流束充電，則水滴從流束上斷開后便帶有同極性的多余表面電荷。下落的水滴通過一對平行板電極形成的靜電場時，帶正電荷的水滴向帶負電的電極板偏轉，這樣就可用容器收集水滴。,第三十九頁，共七十二頁。,（六）FCM測量數據的存貯、顯示與分析 目前FCM數據的存貯的方式均采用列表排隊(List Mode)方式。目前FCM所采用的都是多參數指標，熒光標記物參數數量在逐漸增多(zēnɡ duō)。采用List Mode方式可大量節(jié)約內存和磁盤容量。,第四十頁，共七十二頁。,第四十一頁，共七十二頁。,第三節(jié) 流式細胞儀的主要(zhǔy224。o)性能指標,一、熒光測量靈敏度 靈敏度的高低(gāodī)是衡量儀器檢測微弱熒光信號的重要指標。一般以能檢測到單個微球上最少標有FITC或PE熒光分子數目來表示，現在的FCM均可達到檢測小于100個熒光分子的指標。,第四十二頁，共七十二頁。,二、儀器的分辨率 分辨率是衡量儀器測量(c232。li225。ng)精度的指標，通常用變異系數CV(Coefficient of Variation)值表示： (δ是分布的標準誤差，μ是分布的平均值) 或,第四十三頁，共七十二頁。,三、前向角散射光檢測靈敏度 前向角散射光檢測靈敏度是指能夠檢測到的最小顆粒大小(d224。xiǎo)，一般目前商品化的FCM可以測量到0.2～0.5μm左右。,第四十四頁，共七十二頁。,四、FCM分析速度(s249。d249。) 分析速度以每秒分析的細胞數來表示。 當細胞流過光束的速度超過FCM儀器響應速度時，細胞產生的熒光信號就會丟失，這段時間稱為儀器的死時間。 死時間越短，儀器處理數據越快，一般可達到3000～6000個/秒左右。大型機已達到每秒幾萬個細胞。,第四十五頁，共七十二頁。,五、FCM分選指標 分選指標主要包括分選速度、分選純度和分選收獲率。 分選速度指每秒可提取所要細胞的個數。 分選純度指要分選的目的細胞占分選出細胞的百分比。 分選收獲率指被分出的細胞與原來(yu225。nl225。i)溶液中該細胞的百分比。,第四十六頁，共七十二頁。,第四節(jié) 流式細胞儀應用(y236。ngy242。ng)的技術要求,流式細胞分析儀器(y237。q236。)是一項集多學科知識綜合應用的復雜儀器(y237。q236。)，除了對儀器(y237。q236。)各方面性能指標有嚴格的要求以外，在實驗設計與樣品處理方面也需要有豐富的基礎理論及操作經驗。,第四十七頁，共七十二頁。,一、檢測樣品制備的重
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