【文章內容簡介】 演化為心力衰竭的細胞學機制。,第四十三頁，共一百零六頁。,細胞凋亡(diāo w225。nɡ)與疾病,感染性疾?。?HIV感染可導致AIDS。其感染的細胞學特征是特異性破壞CD4+T淋巴細胞，造成相關免疫功能缺陷，導致感染和腫瘤。在HIV感染過程中，從HIV對CD4+T淋巴細胞黏附、病毒(b236。ngd)顆粒進入細胞、HIV基因組在細胞中復制和裝配以及出芽釋放等環(huán)節(jié)，都與細胞凋亡密切相關。,第四十四頁，共一百零六頁。,細胞凋亡(diāo w225。nɡ)與疾病,其他疾?。?腎小球腎炎和狼瘡腎炎動物模型中均發(fā)現(xiàn)凋亡細胞，這些凋亡細胞可能與腎小球硬化和腎功能衰竭有關。血管動脈粥樣硬化形成過程(gu242。ch233。ng)中，平滑肌細胞的增殖與凋亡同時存在，凋亡對內皮損傷、增殖抑制、粥樣病灶的形成和斑塊的剝脫有一定的影響。,第四十五頁，共一百零六頁。,細胞(x236。bāo)凋亡與疾病,通過對各種疾病細胞凋亡的研究，使我們對疾病的發(fā)生機制有了新的認識，同時也為疾病的治療(zh236。li225。o)提供了新的思路。,第四十六頁，共一百零六頁。,流式細胞(x236。bāo)分析細胞(x236。bāo)凋亡,形態(tài)學特征檢測 凋亡細胞的形態(tài)學變化是細胞發(fā)生凋亡時最可靠的證據(jù)，其直接檢測方法主要是通過對組織或細胞進行各種(ɡ232。 zhǒnɡ)染色，然后在光學顯微鏡或電子顯微鏡下觀察。,第四十七頁，共一百零六頁。,流式細胞分析(fēnxī)細胞凋亡,形態(tài)學特征檢測 凋亡細胞的形態(tài)學變化是細胞發(fā)生凋亡時最可靠的證據(jù)，其直接檢測方法主要是通過對組織(zǔzhī)或細胞進行各種染色，然后在光學顯微鏡或電子顯微鏡下觀察。如通過蘇木素伊紅（HE)染色、吉姆薩（Giemsa)染色、甲基綠哌諾寧染色在普通光學顯微鏡下觀察；通過熒光染料如丫啶橙（AO)、Heochst33258染色在熒光顯微鏡下觀察；或制成超薄切片用電子顯微鏡觀察，以區(qū)別凋亡和壞死。,第四十八頁，共一百零六頁。,流式細胞分析(fēnxī)細胞凋亡,形態(tài)學特征檢測 FCM可間接觀察凋亡(diāo w225。nɡ)細胞形態(tài)學變化，主要是根據(jù)未經(jīng)染色的凋亡(diāo w225。nɡ)細胞的光散射特征進行檢測。,第四十九頁，共一百零六頁。,流式細胞分析(fēnxī)細胞凋亡,形態(tài)學特征檢測 FCM提供的散射光參數(shù)主要包括前向散射光（FSC）和測向散射光（SSC）。FSC主要與細胞大小有關，對同一個細胞群體，散射光強的，其細胞大一些，散射光弱的，其細胞小一些。SSC主要與細胞內部顆粒(kēl236。)密度有關，顆粒(kēl236。)密度越大，SSC就越大，而顆粒(kēl236。)密度越小，SSC就越小。,第五十頁，共一百零六頁。,流式細胞(x236。bāo)分析細胞(x236。bāo)凋亡,形態(tài)學特征檢測 當細胞發(fā)生凋亡(diāo w225。nɡ)的早期，細胞膜完整、細胞皺縮，因此這一階段凋亡(diāo w225。nɡ)細胞FSC較活細胞小，而SSC較之增強或無明顯變化。,第五十一頁，共一百零六頁。,流式細胞分析(fēnxī)細胞凋亡,形態(tài)學特征檢測 當細胞凋亡進一步發(fā)展時，細胞皺縮更加明顯，核質的變化導致細胞內顆粒密度明顯增強，F(xiàn)SC進一步變小，而SSC卻明顯增大。最終，當?shù)蛲鲂◇w形成(x237。ngch233。ng)時，F(xiàn)SC明顯縮小。,第五十二頁，共一百零六頁。,流式細胞分析(fēnxī)細胞凋亡,形態(tài)學特征檢測 此外，也可通過FSC區(qū)分壞死細胞和凋亡細胞。細胞壞死時，由于細胞腫脹，其FSC增大，SSC在細胞壞死時也增大。但晚期凋亡細胞的FSC和SSC與壞死細胞區(qū)分不明顯。當壞死細胞的細胞膜破裂，核質丟失，細胞成為碎片(su236。 pi224。n)時，其FSC和SSC均明顯變小。,第五十三頁，共一百零六頁。,流式細胞分析(fēnxī)細胞凋亡,第五十四頁，共一百零六頁。,流式細胞分析(fēnxī)細胞凋亡,形態(tài)學特征檢測 但實際上，由于被檢測細胞形態(tài)上的均一性和核/質比例不同，凋亡不同階段的細胞，其光散射參數(shù)的變化不同，有時很難準確檢測到凋亡細胞。但將光散射參數(shù)與熒光標記的抗體或熒光染料結合(ji233。h233。)起來檢測細胞凋亡，可以克服單純的光散射參數(shù)的缺點。,第五十五頁，共一百零六頁。,流式細胞分析(fēnxī)細胞凋亡,細胞對染料吸收能力的檢測 凋亡細胞的一個重要特點是很長一段時間里細胞膜結構未受影響，其主要表現(xiàn)為：維持膜的基本功能，如離子和大分子的屏蔽作用和具有(j249。yǒu)功能的通道泵。,第五十六頁，共一百零六頁。,流式細胞分析(fēnxī)細胞凋亡,細胞對染料(rǎnli224。o)吸收能力的檢測 根據(jù)不同功能狀態(tài)下的細胞對染料的吸收或排斥作用不同，可用流式細胞儀定量檢測活細胞、凋亡細胞和壞死細胞的百分比。,第五十七頁，共一百零六頁。,流式細胞分析(fēnxī)細胞凋亡,細胞對染料吸收能力的檢測 處于早/中期的凋亡細胞，仍然保持著完整的質膜及其基本功能，阻礙大分子物質及離子進入細胞內。而晚期(wǎnqī)凋亡細胞或壞死細胞，其質膜完整性受到破壞，使某些大分子物質及離子可以進入細胞內。因此，根據(jù)對DNA染料通透性的不同，可區(qū)分處于不同階段的細胞。,第五十八頁，共一百零六頁。,流式細胞(x236。bāo)分析細胞(x236。bāo)凋亡,細胞(x236。bāo)對染料吸收能力的檢測 PI和EB均屬于插入性熒光染料，可選擇性的定量嵌入核酸雙螺旋的堿基之間，其熒光發(fā)射均為橙紅色，如果使用氬離子激光488nm激發(fā)，PI的發(fā)射光譜波長在610620nm范圍，EB的發(fā)射光譜波長在603610nm之間，二者可互相替代，但EB毒性較大。,第五十九頁，共一百零六頁。,流式細胞分析(fēnxī)細胞凋亡,細胞(x236。bāo)對染料吸收能力的檢測 7氨基放線菌素D（7AAD）主要以插入方式與DNA鏈的GC堿基對結合，其激發(fā)波長約為580nm，最大發(fā)射波長為660nm，由于其發(fā)射波長較大，可與藻紅蛋白（PE）結合，通過單一光譜488nm的激光光源激發(fā)，可以進行定量DNA和免疫熒光的雙參數(shù)分析。,第六十頁，共一百零六頁。,流式細胞(x236。bāo)分析細胞(x236。bāo)凋亡,細胞對染料吸收能力的檢測 由于EB、PI和7AAD不能進入(j236。nr249。)具有完整細胞膜的活細胞中，即正常細胞和凋亡細胞在未固定時對這些染料是拒染的，而壞死細胞胞膜完整性已破壞，可被染色。因此，這些染料可被用來鑒別死細胞和活細胞。,第六十一頁，共一百零六頁。,流式細胞(x236。bāo)分析細胞(x236。bāo)凋亡,細胞對染料吸收能力的檢測 赫斯特類染料（特別是HO33342)檢測細胞凋亡的原理(yu225。nlǐ)與上述染料不同。HO33342是雙苯并咪唑家族成員之一，能特異與DNA螺旋中富含AT重復序列結合。HO33342用氪激光激發(fā)紫外線熒光，激發(fā)光波長為352nm，發(fā)射光波長為400500nm，產(chǎn)生藍色熒光。,第六十二頁，共一百零六頁。,流式細胞分析(fēnxī)細胞凋亡,細胞對染料吸收能力的檢測 HO33342能被活細胞攝取，而其從細胞內排出是一個耗能的主動過程，依賴細胞膜上的P糖蛋白泵。活細胞染色時，應考慮是否存在細胞抗藥性問題，如有耐藥性，則染色效果不佳。HO33342進入凋亡細胞比正常細胞多，將其與PI結合(ji233。h233。)對凋亡細胞進行雙染，可將正常細胞、凋亡細胞和壞死細胞區(qū)分開來。,第六十三頁，共一百零六頁。,流式細胞(x236。bāo)分析細胞(x236。bāo)凋亡,細胞對染料吸收能力的檢測 在雙變量流式細胞儀的散點圖上，這三群細胞表現(xiàn)為：正常細胞低藍光/低紅光，凋亡(diāo w225。nɡ)細胞為高藍光/低紅光，壞死細胞為低藍光/高紅光。,第六十四頁，共一百零六頁。,流式細胞(x236。bāo)分析細胞(x236。bāo)凋亡,caspase的流式細胞儀檢測 caspase家族在細胞凋亡過程中起著重要