20xx年醫(yī)學(xué)專題—流式細胞儀原理和一般用法(編輯修改稿)
2024-11-15 05:37 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 節(jié), 所以用戶操作十分方便。,第十九頁，共五十四頁。,,Partec Excellence in Flow Cytometry,超過41年的研發(fā)(y225。n fā)經(jīng)驗,光學(xué)系統(tǒng),流式細胞儀的光學(xué)系統(tǒng)是由若干組透鏡、濾光片、小孔組成，它們分別將不同波長的熒光信號送入到不同的電子探測器。 在流式細胞儀的光學(xué)系統(tǒng)中主要光學(xué)原件(yu225。n ji224。n)是濾光片，主要分為三類：,長通濾片 LP 短通濾片 SP 帶通濾片 BP,第二十頁，共五十四頁。,,Partec Excellence in Flow Cytometry,超過(chāogu242。)41年的研發(fā)經(jīng)驗,長通濾片,長通濾片使特定(t232。d236。ng)波長以上的光通過，特定(t232。d236。ng)波長以下的不通過。如LP500濾片，將允許500 nm以上的光通過，而500 nm以下的光吸收或返回。,第二十一頁，共五十四頁。,,Partec Excellence in Flow Cytometry,超過(chāogu242。)41年的研發(fā)經(jīng)驗,短通濾片,與長通濾片相反，特定波長以下(yǐxi224。)的光通過，特定波長以上的光吸收或返回。,第二十二頁，共五十四頁。,,Partec Excellence in Flow Cytometry,超過(chāogu242。)41年的研發(fā)經(jīng)驗,帶通濾片,帶通濾片可允許相當(dāng)窄的一波長范圍內(nèi)光通過，一般(yībān)濾片上有兩個數(shù)，一個為允許通過波長的中心值，另一為允許通過光波段的范圍。如BP 500 / 50表示其允許通過波長范圍為475nm~525nm。,第二十三頁，共五十四頁。,,Partec Excellence in Flow Cytometry,超過(chāogu242。)41年的研發(fā)經(jīng)驗,信號(x236。nh224。o)檢測與分析,當(dāng)細胞攜帶熒光素標記物，通過激光照射區(qū)時，受激光激發(fā)，產(chǎn)生代表(d224。ibiǎo)細胞內(nèi)不同物質(zhì)、不同波長的熒光信號，這些信號以細胞為中心，向空間360度立體角發(fā)射，產(chǎn)生散射光和熒光信號, 下圖是以激發(fā)光光源波長488nm為例的示意圖：,第二十四頁，共五十四頁。,,Partec Excellence in Flow Cytometry,超過(chāogu242。)41年的研發(fā)經(jīng)驗,1.散射光信號：散射光分為前向角散射( FSC ，F(xiàn)orward Scatter ) 和側(cè)向角散射(SSC，Side Scatter)，散射光不依賴任何細胞樣品的制備技術(shù)(如染色)，因此被稱為細胞的物理參數(shù)（或稱固有參數(shù)）。 (1)前向角散射：代表細胞體積大小，前向角散射與被測細胞的大小有關(guān)，確切說與細胞直徑的平方密切相關(guān)，通常在FCM應(yīng)用中，選取FSC作閾值，來排除樣品中的各種(ɡ232。 zhǒnɡ)碎片及鞘液中的小顆粒，以避免對被測細胞的干擾。 (2)側(cè)向角散射：代表細胞內(nèi)容物多少（或稱為密度），側(cè)向角散射是指與激光束正交900方向的散射光信號，側(cè)向散射光對細胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感，可提供有關(guān)細胞內(nèi)精細結(jié)構(gòu)和顆粒性質(zhì)的信息。,2.熒光信號：當(dāng)激光光束與細胞正交時，一般會產(chǎn)生兩種熒光信號。一種是細胞自身(z236。shēn)在激光照射下發(fā)出微弱的熒光信號，稱為細胞自發(fā)熒光；另一種是經(jīng)過特異熒光素標記細胞后，受激發(fā)照射得到的熒光信號，通過對這類熒光信號的檢測和定量分析就能了解所研究細胞參數(shù)的存在與定量。,第二十五頁，共五十四頁。,,Partec Excellence in Flow Cytometry,超過(chāogu242。)41年的研發(fā)經(jīng)驗,光電倍增管如何(rh233。)產(chǎn)生電壓脈沖信號,電壓(di224。nyā)脈沖,第二十六頁，共五十四頁。,,Partec Excellence in Flow Cytometry,超過(chāogu242。)41年的研發(fā)經(jīng)驗,高度(gāod249。)、寬度和面積,時間(sh237。jiān) (181。s),電壓,脈沖面積(A),脈沖高度 (H),脈沖寬度(W),40,0,第二十七頁，共五十四頁。,,Partec Excellence in Flow Cytometry,超過41年的研發(fā)(y225。n fā)經(jīng)驗,脈沖信號(x236。nh224。o)的寬度和面積通常用來辨別雙粘體細胞,第二十八頁，共五十四頁。,,Partec Excellence in Flow Cytometry,超過(chāogu242。)41年的研發(fā)經(jīng)驗,閾 值,,閾值用來定義能夠被光電倍增管識別(sh237。bi233。)的最小或最大信號強度，低于閾值下限或高于閾值上限的信號將不被光電倍增管識別(sh237。bi233。)，也不在圖形中顯示。,第二十九頁，共五十四頁。,,Partec Excellence in Flow Cytometry,超過(chāogu242。)41年的研發(fā)經(jīng)驗,熒光信號(x236。nh224。o)的線性測量和對數(shù)測量,線性放大： 即放大器的輸出與輸入(shūr249。)是線性關(guān)系，細胞DNA含量、RNA含量、總蛋白質(zhì)含量等的測量一般選用線性放大測量。 對數(shù)放大： 即放大器的輸出成10倍關(guān)系，如果原來輸出是1，當(dāng)輸入增大到原來10倍時，輸出為2；當(dāng)輸入增大到原來100倍時輸出是3等等。 在免疫學(xué)樣品中，細胞膜表面抗原的分布有時要差幾十倍甚至幾萬倍。如果用線性放大將無法在一張圖上清晰地將細胞陽性群、陰性群同時顯示出來。 。,第三十頁，共五十四頁。,,Partec Excellence in Flow Cytometry,超過41年的研發(fā)(y225。n fā)經(jīng)驗,流式細胞儀數(shù)據(jù)格式,FCS：幀校驗序列（FCS）字段，通常為1
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