【文章內(nèi)容簡介】 檢測DNA含量,第六十四頁，共一百四十三頁。,Nucleic acid Probes,菲啶基 Propidium Iodide Ethidium Bromide 苯甲亞胺 Hoechst 33342 抗生素 Mithramycin, Chromamycin A3 Acridine Orange AO Pyronyn Y,第六十五頁，共一百四十三頁。,,,G2,M,G0,G1,s,0,200,400,600,800,1000,s,DNA Analysis,DNA content,Count,Normal Cell Cycle,第六十六頁，共一百四十三頁。,A typical DNA Histogram,G0G1,S,G2M,Fluorescence Intensity, of Events,第六十七頁，共一百四十三頁。,紅色為正常(zh232。ngch225。ng)二倍體細(xì)胞；黃色為異倍體細(xì)胞,第六十八頁，共一百四十三頁。,第六十九頁，共一百四十三頁。,增殖相關(guān)(xiāngguān)基因,PCNA(Proliferating cell nuclear antigen) 一種蛋白質(zhì)，在DNA復(fù)制(f249。zh236。)和核苷酸的切除修復(fù)中起到作用 Ki67 proliferation related antigen KiS1 proliferation related antigen Phosphohistone Cyclin D1, E, A, B1,第七十頁，共一百四十三頁。,BrdUrd Incorporation,Bromodeoxyuridine (BrdU) 是一個胸腺核苷的類似物 能夠在細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期狀態(tài)分析中起作用 BrdU能與正在復(fù)制周期內(nèi)的細(xì)胞相結(jié)合 使用(shǐy242。ng)BrdU抗體能夠檢測到BrdU,第七十一頁，共一百四十三頁。,BrdUrd Incorporation,第七十二頁，共一百四十三頁。,細(xì)胞分裂的分析(fēnxī),哺乳動物的免疫系統(tǒng)需要有大量的增殖，能夠確?？乖?k224。ngyu225。n)特異性的T細(xì)胞和B細(xì)胞具有足夠的增殖速度，能夠?qū)Ω吨尾∩镌斐傻母腥?CFSE是一種示蹤染料，能夠均等地在兩個子代細(xì)胞中分布，其結(jié)果可以區(qū)分出810代的子細(xì)胞。,第七十三頁，共一百四十三頁。,Tracing Dye(CFSE),第七十四頁，共一百四十三頁。,Apoptotic Cell Death a genetically encoded cell death program, which is morphologically, biochemically and molecularly distinct from necrosis,第七十五頁，共一百四十三頁。,Flow cytometry of apoptotic cell death,細(xì)胞散射光 在細(xì)胞調(diào)亡中，細(xì)胞收縮，從而FSC下降，SSC上升(sh224。ngshēng)或是沒有明顯變化,第七十六頁，共一百四十三頁。,第七十七頁，共一百四十三頁。,Flow cytometry of apoptotic cell death,熒光吸收 細(xì)胞的胞膜對于(du236。y)DNA染料的通透性和細(xì)胞的活性、死亡和凋亡相關(guān)，像PI、EB、Hoechst33342等，可以用來區(qū)分活細(xì)胞、死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞,第七十八頁，共一百四十三頁。,Flow cytometry of apoptotic cell death,FCM of Caspases 通過抗體和活化的caspase3片斷相結(jié)合來檢測 使用特異性的caspase3熒光(y237。ngguāng)底物 新的抗原決定基CK18,第七十九頁，共一百四十三頁。,第八十頁，共一百四十三頁。,Flow cytometry of apoptotic cell death,線粒體功能的變化 TMP會在調(diào)亡中產(chǎn)生，可以通過一些標(biāo)記(biāoj236。)用流式細(xì)胞儀檢測。使用有膜穿透性的親脂性陽離子熒光染料，如Rh123, DiOC6, JC1,CMXRos等，可作為流式檢測的探針。 當(dāng)細(xì)胞發(fā)生調(diào)亡時，一個線粒體膜表面蛋白——7A6抗原會出現(xiàn) Bcl2/bax family of proteins.,第八十一頁，共一百四十三頁。,第八十二頁，共一百四十三頁。,第八十三頁，共一百四十三頁。,Flow cytometry of apoptotic cell death,鈣離子流和 pH值變化 胞漿內(nèi)Ca2+ 水平(shuǐp237。ng)的上升和由于細(xì)胞內(nèi)環(huán)境酸化造成的選擇性的pH值的調(diào)節(jié)降低是伴隨著細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的后果之一。 使用Ca2+ 選擇性熒光探針，如 Quin2, Fluo3, Indo1 通過流式檢測是測定細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的最佳方案 酸化的檢測同樣可以用對pH敏感的熒光探針，如 DCH, BCECF, BCECFAM, SNAFLs, SNARFs等進(jìn)行檢測,第八十四頁，共一百四十三頁。,Flow cytometry of apoptotic cell death Phospholipid redistribution,第八十五頁，共一百四十三頁。,第八十六頁，共一百四十三頁。,Flow cytometry of apoptotic cell death,DNA 鏈的斷裂 細(xì)胞凋亡晚期中，核酸內(nèi)切酶（某些Caspase的底物）在核小體之間剪切核DNA，產(chǎn)生大量長度在180200 bp 的DNA片段。 斷裂的末端(m242。 duān)可以通過末端(m242。 duān)轉(zhuǎn)脫氧核苷酰酶(TdT)連接上dUTP。,第八十七頁，共一百四十三頁。,第八十八頁，共一百四十三頁。,第八十九頁，共一百四十三頁。,第九十頁，共一百四十三頁。,Flow cytometry of apoptotic cell death,細(xì)胞DNA含量 在凋亡細(xì)胞中，用PI染色，通過流式檢測DNA含量，可以發(fā)現(xiàn)一種(yī zhǒnɡ)亞群的細(xì)胞，其染色熒光強(qiáng)度下降。這是由于隨著調(diào)亡的進(jìn)行，核酸內(nèi)切酶活化，隨后一部分DNA泄漏出去，造成細(xì)胞內(nèi)DNA含量下降造成的。,第九十一頁，共一百四十三頁。,Flow Cytometry of Apoptotic Cells,第九十二頁，共一百四十三頁。,An Integrated Approach to Cell Immunology,第九十三頁，共一百四十三頁。,Immune Function assay,免疫(miǎny236。)細(xì)胞亞群檢測 Antigenpeptide specific T cells 檢測 Tcells 活化 Treg Cells 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子/趨化因子檢測 磷酸化,第九十四頁，共一百四十三頁。,淋巴細(xì)胞亞群分析(fēnxī),根據(jù)功能，淋巴細(xì)胞主要分為 B淋巴細(xì)胞（CD19+），與體液免疫有關(guān) T淋巴細(xì)胞（CD3+），與細(xì)胞免疫有關(guān) 總T和總B可以用來判斷某些免疫缺陷和自身免疫性疾病 NK細(xì)胞（CD3CD16+56+），行使免疫監(jiān)控(jiān k242。nɡ)功能， 能夠介導(dǎo)對某些腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。,第九十五頁，共一百四十三頁。,淋巴細(xì)胞亞群分析(fēnxī),根據(jù)CDCD8表達(dá)，T淋巴細(xì)胞又分為 T輔助/誘導(dǎo)細(xì)胞（CD3+CD4+） T抑制/細(xì)胞毒性細(xì)胞（CD3+CD8+） Th/Ts 評價那些自身免疫(miǎny236。)失調(diào)或被懷疑是免疫(miǎny236。)失調(diào)或已知患有免疫(miǎny236。)缺陷的病人的免疫(miǎny236。)狀態(tài)，此外，這一比值還可用來監(jiān)測骨髓移植病人以免受到急性GVHD的攻擊 Th/Ts升高：自身免疫性疾?。愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、SLE） Th/Ts降低：病毒感染、惡性腫瘤、再生障礙性貧血,第九十六頁，共一百四十三頁。,第九十七頁，共一百四十三頁。,Traditional Analysis Percent p