【文章內容簡介】 的基本(jīběn)結構（３）,散射光信號(x236。nh224。o),40,流式細胞儀,第四十頁，共九十四頁。,I I 流式細胞儀的基本(jīběn)結構（３）,熒光(y237。ngguāng)信號（fluorescence，F(xiàn)L） 被熒光染料染色的細胞在通過測量區(qū)時，細胞中的特異熒光染料受激發(fā)而產生熒光信號，其強度表示待檢測物質的多少。熒光信號檢測系統(tǒng)由濾片和檢測器組成，與入射激光成90176。放置。濾片用以濾除非熒光信號；熒光檢測器多用光電倍增管。熒光波長與激發(fā)光波長不同且強度轉弱，須使用一系列靈敏的光學元件才能分離出不同的熒光信號。,41,流式細胞儀,第四十一頁，共九十四頁。,I I 流式細胞儀的基本(jīběn)結構（３）,熒光信號(x236。nh224。o)：細胞中熒光素含量與信號(x236。nh224。o)的關系,42,流式細胞儀,第四十二頁，共九十四頁。,I I 流式細胞儀的基本(jīběn)結構（３）,熒光信號：細胞(x236。bāo)中熒光素分布與信號的關系,43,流式細胞儀,第四十三頁，共九十四頁。,I I 流式細胞儀的基本(jīběn)結構（４）,信號處理系統(tǒng) 檢測器以每秒1000~2000個細胞的速度探測細胞的散射(sǎnsh232。)光和熒光信息，經過A/D轉換器變成二進制信號，儲存于計算機中，每個細胞的光散射(sǎnsh232。)及熒光測量數(shù)據(jù)一般以列表或矩陣方式儲存。計算機通過綜合、處理、分析這些信息，可直接計算出所需結果。,44,流式細胞儀,第四十四頁，共九十四頁。,I I 流式細胞儀的基本(jīběn)結構（４）,電壓(di224。nyā)脈沖定量分析與數(shù)字轉換（1）,45,流式細胞儀,第四十五頁，共九十四頁。,I I 流式細胞儀的基本(jīběn)結構（４）,電壓脈沖(m224。ichōng)定量分析與數(shù)字轉換（2）：脈沖高度,46,流式細胞儀,第四十六頁，共九十四頁。,I I 流式細胞儀的基本(jīběn)結構（４）,細胞信號的顯示 ① 一維直方圖（histogram） 單參數(shù)直方圖表示一個參數(shù)與細胞(x236。bāo)數(shù)量間的關系。在圖中，橫坐標（X軸）表示熒光或散射光強度的相對值，其單位用在流式細胞(x236。bāo)儀中用“道（channel）”表示，道數(shù)與熒光強度之間是線性或對數(shù)關系，依儀器分析時放大器的性質而定?？v坐標（Y軸）通常代表細胞(x236。bāo)出現(xiàn)的頻率或相對細胞(x236。bāo)數(shù)量，絕對細胞(x236。bāo)數(shù)較少使用。在直方圖中，每個峰表示在某些方面性質相同的一群細胞(x236。bāo)，若用“標尺”把各峰分開成區(qū)間，即可統(tǒng)計分析出各個區(qū)間內細胞(x236。bāo)所占百分比、及光散射或熒光強度的峰值、平均值、標準差、變異系數(shù)等。,47,流式細胞儀,第四十七頁，共九十四頁。,I I 流式細胞儀的基本(jīběn)結構（４）,直方圖,48,流式細胞儀,第四十八頁，共九十四頁。,I I 流式細胞儀的基本(jīběn)結構（４）,直方圖,49,流式細胞儀,第四十九頁，共九十四頁。,I I 流式細胞儀的基本(jīběn)結構（４）,直方圖,50,流式細胞儀,第五十頁，共九十四頁。,I I 流式細胞儀的基本(jīběn)結構（４）,直方圖 標準(biāozhǔn)熒光微球的熒光直方圖：測試前必須用標準(biāozhǔn)熒光微球校準儀器。,51,流式細胞儀,第五十一頁，共九十四頁。,I I 流式細胞儀的基本(jīběn)結構（４）,直方圖 T淋巴細胞單色直接免疫熒光染色的熒光直方圖：以藍色直方圖為同型對照設定陰性(yīnx236。ng)與陽性細胞界標（Marker，M1），凡在M1左邊的細胞為陰性(yīnx236。ng)，右邊的細胞為陽性。,52,流式細胞儀,第五十二頁，共九十四頁。,I I 流式細胞儀的基本(jīběn)結構（４）,細胞信號分析的主要形式 ② 二維點圖（dot plot） 二維點圖表示兩個參數(shù)與細胞數(shù)量間的關系。任選FSC、SSC、FL1~FL3中兩個參數(shù)為X軸和Y軸，就可得到二維點圖。在二維點圖中，每個點代表一個細胞，根據(jù)細胞性質的不同，在二維點圖上就會出現(xiàn)若干群細胞，即為不同的細胞亞群。若用“門”把各亞群細胞分開(fēn kāi)并進行統(tǒng)計分析，可得各亞群細胞所占百分比、及平均熒光強度等。,53,流式細胞儀,第五十三頁，共九十四頁。,I I 流式細胞儀的基本(jīběn)結構（４）,二維點圖,54,流式細胞儀,第五十四頁，共九十四頁。,I I 流式細胞儀的基本(jīběn)結構（４）,二維點圖 白細胞散射光FSC/SSC二維點圖及二維密度(m236。d249。)圖。,55,流式細胞儀,第五十五頁，共九十四頁。,I I 流式細胞儀的基本(jīběn)結構（４）,二維點圖 T細胞(x236。bāo)亞群CD3/CD4和CD3/CD8二維點圖：CD3/CD4雙陽性細胞(x236。bāo)（T輔助細胞(x236。bāo)）占45.04%。CD3/CD8雙陽性細胞(x236。bāo)（T抑制細胞(x236。bāo)）占34.05%。,56,流式細胞儀,第五十六頁，共九十四頁。,I I 流式細胞儀的基本(jīběn)結構（４）,細胞信號分析的主要形式 ③ 假三維圖及二維等高圖（contour） 假三維圖：任選FSC、SSC、FL1~FL3中任何兩個參數(shù)為X軸和Y軸，以細胞數(shù)量為Z軸，就構成了三維圖。因Z軸細胞數(shù)量不是(b249。 shi)直接測量參數(shù)，實際上仍是二維圖，故稱為假三維圖。該圖對細胞亞群的觀察更為直觀。 二維等高圖：用不同高度的平面切割假三維圖，將這些切割投影到X、Y平面上，就形成了等高圖，等高圖由類似地圖上的等高線組成，等高線密集的地方，就是細胞數(shù)變化快的地方。該圖對觀察細胞的分布趨勢優(yōu)于二維點圖。,57,流式細胞儀,第五十七頁，共九十四頁。,I I 流式細胞儀的基本(jīběn)結構（４）,假三維圖及等高圖 白細胞散射光FSC、SSC假三維圖（左）與等高圖（右）。,58,流式細胞儀,第五十八頁，共九十四頁。,I I 流式細胞儀的基本(jīběn)結構（４）,細胞信號分析(fēnxī)的主要形式 ④ 三維圖（3D）及四參數(shù)平面圖 三維圖：在FSC、SSC、FL1~FL3中任選三個參數(shù)為X軸、Y軸和Z軸，就構成了一個三維圖，在三維空間中，每一群細胞各處于獨立的空間位置。該圖對復雜的細胞亞群分析更為直觀、準確，但對其數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析較難。 四參數(shù)平面圖：四參數(shù)平面圖分析對數(shù)據(jù)分布的觀察也有一定意義。,59,流式細胞儀,第五十九頁，共九十四頁。,I I 流式細胞儀的基本(jīběn)結構（４）,三維圖 白細胞CD4CD1SSC三參數(shù)三維圖： 紅色淋巴細胞 黃色嗜堿性(jiǎn x236。nɡ)粒細胞 天藍單核細胞 藍色中性粒細胞 品紅嗜酸性粒細胞,60,流式細胞儀,第六十頁，共九十四頁。,I I 流式細胞儀的基本(jīběn)結構（４）,四參數(shù)平面圖 白細胞FSC、SSC、CD4CD1SSC四參數(shù)平面圖： 紅色淋巴細胞 黃色嗜堿性(jiǎn x236。nɡ)粒細胞 天藍單核細胞 藍色中性粒細胞 品紅嗜酸性粒細胞。,61,流式細胞儀,第六十一頁，共九十四頁。,I I 流式細胞儀的基本(jīběn)結構（４）,細胞信號的分析 散射光信號(x236。nh224。o)分析 熒光信號分析 散射光/熒光信號分析,62,流式細胞儀,第六十二頁，共九十四頁。,I I 流式細胞儀的基本(jīběn)結構（４）,散射光分析(fēnxī) 散射光（FSC、SSC）可用直方圖、二維點圖、假三維圖、三維圖等分析,A白細胞 FSC直方圖。 B白細胞 SSC直方圖。 C白