20xx年醫(yī)學(xué)專題—流式細(xì)胞術(shù)的原理和應(yīng)用(編輯修改稿)
2024-11-15 05:41 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 統(tǒng)，根據(jù)不同造血因子能誘導(dǎo)干細(xì)胞或定向造血祖細(xì)胞形成某一種(yī zhǒnɡ)或某些種類細(xì)胞的集落，通過對形成集落形態(tài)學(xué)、酶學(xué)鑒定，計算不同種類集落形成的數(shù)量和比例，反映待測標(biāo)本中CSF的種類和活性水平。,第四十九頁，共一百一十五頁。,C. 直接(zh237。jiē)殺傷靶細(xì)胞,細(xì)胞因子TNFα、TNFβ具有直接殺傷某些腫瘤細(xì)胞的作用，采用TNF敏感的細(xì)胞株如小鼠成纖維細(xì)胞株L929，以WEHI164亞克隆13（鼠纖維肉瘤細(xì)胞系）作為指示細(xì)胞，通過(tōnggu242。)3HTdR釋放法或染料染色等可檢測待檢樣品中TNF的活性水平。,第五十頁，共一百一十五頁。,D. 抗病毒效應(yīng)(xi224。oy236。ng),靶細(xì)胞受某些病毒感染后可發(fā)生明顯病變和死亡，干擾素可保護靶細(xì)胞免受病毒的攻擊； 常用的病毒是水皰性口炎病毒（vesicular stomatitis virus, VSV），敏感的指示細(xì)胞為喉癌的上皮細(xì)胞株Hep2和羊膜(y225。ngm243。)的上皮細(xì)胞WISH，通過干擾素（IFNα、IFNβ、IFNγ）抑制病毒致病變的程度，計算出待測樣品中IFN的活性單位。,第五十一頁，共一百一十五頁。,E. 趨化作用(zu242。y242。ng),IL8對多形核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞具有趨化作用，可用小室法或軟瓊脂(qi243。ngzhī)趨化法，PMN或淋巴細(xì)胞作為指示細(xì)胞，以細(xì)胞趨化的程度來反映樣品中IL8活性水平。,第五十二頁，共一百一十五頁。,F. 抗體(k224。ngtǐ)形成法,IL6可在體外刺激某些B淋巴細(xì)胞系產(chǎn)生(chǎnshēng)和分泌免疫球蛋白； 指示細(xì)胞：分泌IgG的ARH7CESS 分泌IgM的SKW6.CL4 方法：在一定條件下，待檢樣品中IL6水平與培養(yǎng)細(xì)胞上清IgG或IgM水平正相關(guān)，通過標(biāo)準(zhǔn)IL6的對照可推算出待檢樣品中IL6的活性。,第五十三頁，共一百一十五頁。,IL2的誘生及生物(shēngw249。)活性測定（試驗四）,第五十四頁，共一百一十五頁。,一般(yībān)方法,細(xì)胞因子敏感的細(xì)胞株 細(xì)胞因子的標(biāo)準(zhǔn)品及待測品 指示劑：MTT，3HTdR 酶聯(lián)免疫吸附測定儀測定OD值 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(qūxi224。n) 標(biāo)準(zhǔn)品50%最大OD值 找出與標(biāo)準(zhǔn)品50%最大OD值相對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋度(S) 找出與標(biāo)準(zhǔn)品50%最大OD值相對應(yīng)的待測品稀釋度(A) 待測品單位數(shù)=S/A標(biāo)準(zhǔn)品單位,第五十五頁，共一百一十五頁。,稀釋(xīsh236。)度,OD值,1/8 1/4 S 1/2 A 1,100%OD,50%OD,標(biāo)準(zhǔn)(biāozhǔn)品,待測品,第五十六頁，共一百一十五頁。,對生物學(xué)活性測定法的評價(p237。ngji224。),優(yōu)點：靈敏度高； 測定的是有生物活性的細(xì)胞因子 缺點：維持靶細(xì)胞株，操作繁雜和難定量(d236。ngli224。ng) 特異性差 實驗周期較長 易受其它因素的影響,第五十七頁，共一百一十五頁。,3. 免疫化學(xué)測定法,用來檢測細(xì)胞因子蛋白質(zhì)的抗原特性，利用抗體對抗原表位的識別，測定的是可溶性細(xì)胞因子的抗原性。 基本原理是細(xì)胞因子（或受體）與相應(yīng)的特異性抗體（單克隆抗體或多克隆抗體）結(jié)合，通過同位素、熒光素或酶等標(biāo)記技術(shù)加以放大(f224。ngd224。)和顯示，從而定性或定量顯示細(xì)胞因子（或受體）的水平。 免疫標(biāo)記技術(shù),第五十八頁，共一百一十五頁。,Radioimmunoassay Immunofluorescence 酶免疫分析 (EIA)：ELISA：體液中的細(xì)胞因子 免疫組織化學(xué) ELISPOT：分泌(fēnm236。)細(xì)胞因子的T細(xì)胞（頻率）,第五十九頁，共一百一十五頁。,60,第六十頁，共一百一十五頁。,（三）胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(jiǎn c232。)方法,測定的是細(xì)胞因子的前體分子，是單一(dānyī)細(xì)胞行為； 一般要用先活化細(xì)胞，使之合成欲測細(xì)胞因子。在活化過程中加入蛋白質(zhì)運輸抑制物，如莫能菌素(monensin)和布雷菲爾德菌素A，阻止了細(xì)胞因子分泌，提高了胞內(nèi)檢測的陽性率； 檢測方法：ELISPOT 熒光標(biāo)記：熒光顯微鏡或FCM,第六十一頁，共一百一十五頁。,活化劑,活化(hu243。hu224。)T細(xì)胞：除特異性抗原外，主要植物血凝素(PHA)、巴豆酯(PMA)、離子霉素（ionomycin）、鈣離子載體A2318T細(xì)胞受體抗體或CD3的抗體等； 活化B細(xì)胞：特異性抗原，脂多糖（LPS）、金黃色葡萄球菌腸內(nèi)毒素A、B細(xì)胞受體抗體； 活化單核細(xì)胞：LPS和某些細(xì)胞因子。,第六十二頁，共一百一十五頁。,人外周血單個核細(xì)胞IL17A流式檢測(jiǎn c232。)方法,第六十三頁，共一百一十五頁。,人外周血單個核細(xì)胞（PBMC ）的分離； 調(diào)整細(xì)胞濃度接種24孔板或96孔板； 加入Brefeldin A，PMA和ionomycin （離子霉素 ），進行細(xì)胞培養(yǎng)； 一定(yīd236。ng)時間后，收集細(xì)胞進行表面抗原染色（如CD4或CD8）、固定和通透、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色、流式細(xì)胞儀測定和結(jié)果分析。,第六十四頁，共一百一十五頁。,(1) 抗凝 靜脈血,(2) 加等量(děnɡ li224。nɡ)NS,(4) 密度梯度離心(l237。xīn),(3) 混勻后，緩慢(huǎnm224。n)加于分離液上,第六十五頁，共一百一十五頁。,圖1. 表達(dá)IL17和IFN?的CD4+T細(xì)胞(x236。bāo)分析,圖2. CD4+T細(xì)胞表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子(yīnzǐ)FoxP3的檢測,第六十六頁，共一百一十五頁。,（四）細(xì)胞因子檢測(jiǎn c232。)的臨床應(yīng)用,機體免疫狀態(tài)的評估； 疾病預(yù)后及治療監(jiān)測指標(biāo)(zhǐbiāo)； 病理變化和損傷機理研究； 輔助診斷。,第六十七頁，共一百一十五頁。,三、常用免疫(miǎny236。)細(xì)胞功能檢測方法,評價機體的特異性和非特異性免疫(miǎny236。)功能,第六十八頁，共一百一十五頁。,內(nèi)容(n232。ir243。ng),淋巴細(xì)胞的功能檢
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