20xx年醫(yī)學(xué)專題—流式細(xì)胞術(shù)的原理和應(yīng)用-文庫吧資料
2024-11-15 05:41本頁面
【正文】 七十四頁，共一百一十五頁。nlǐ)：,淋巴細(xì)胞,DNA合成(h233。,（1）T淋巴細(xì)胞增殖(zēngzh237。d236。,1. T細(xì)胞(x236。) B細(xì)胞：介導(dǎo)體液免疫 NK細(xì)胞：固有免疫,第七十一頁，共一百一十五頁。ng)檢測,淋巴細(xì)胞功能測定可分為體內(nèi)實驗和體外實驗； 體內(nèi)實驗主要是間接了解(liǎojiě)淋巴細(xì)胞對抗原、半抗原或有絲分裂原的應(yīng)答反應(yīng)； 體外實驗主要包括淋巴細(xì)胞對抗原或有絲分裂原刺激后的增殖反應(yīng)、細(xì)胞毒性試驗及淋巴細(xì)胞分泌產(chǎn)物的測定,第七十頁，共一百一十五頁。nɡ)應(yīng)用,第六十九頁，共一百一十五頁。ng),淋巴細(xì)胞的功能檢測 T細(xì)胞功能檢測 B細(xì)胞功能檢測 NK細(xì)胞功能檢測 吞噬細(xì)胞功能檢測 免疫細(xì)胞功能檢測的臨床(l237。,內(nèi)容(n232。)細(xì)胞功能檢測方法,評價機體的特異性和非特異性免疫(miǎny236。,第六十七頁，共一百一十五頁。,（四）細(xì)胞因子檢測(jiǎn c232。,圖1. 表達(dá)IL17和IFN?的CD4+T細(xì)胞(x236。xīn),(3) 混勻后，緩慢(huǎnm224。,(1) 抗凝 靜脈血,(2) 加等量(děnɡ li224。ng)時間后，收集細(xì)胞進行表面抗原染色（如CD4或CD8）、固定和通透、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色、流式細(xì)胞儀測定和結(jié)果分析。)方法,第六十三頁，共一百一十五頁。,第六十二頁，共一百一十五頁。hu224。在活化過程中加入蛋白質(zhì)運輸抑制物，如莫能菌素(monensin)和布雷菲爾德菌素A，阻止了細(xì)胞因子分泌，提高了胞內(nèi)檢測的陽性率； 檢測方法：ELISPOT 熒光標(biāo)記：熒光顯微鏡或FCM,第六十一頁，共一百一十五頁。,（三）胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(jiǎn c232。)細(xì)胞因子的T細(xì)胞（頻率）,第五十九頁，共一百一十五頁。 免疫標(biāo)記技術(shù),第五十八頁，共一百一十五頁。ngd224。,3. 免疫化學(xué)測定法,用來檢測細(xì)胞因子蛋白質(zhì)的抗原特性，利用抗體對抗原表位的識別，測定的是可溶性細(xì)胞因子的抗原性。ngli224。ngji224。)度,OD值,1/8 1/4 S 1/2 A 1,100%OD,50%OD,標(biāo)準(zhǔn)(biāozhǔn)品,待測品,第五十六頁，共一百一十五頁。n) 標(biāo)準(zhǔn)品50%最大OD值 找出與標(biāo)準(zhǔn)品50%最大OD值相對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋度(S) 找出與標(biāo)準(zhǔn)品50%最大OD值相對應(yīng)的待測品稀釋度(A) 待測品單位數(shù)=S/A標(biāo)準(zhǔn)品單位,第五十五頁，共一百一十五頁。)活性測定（試驗四）,第五十四頁，共一百一十五頁。,第五十三頁，共一百一十五頁。,F. 抗體(k224。ngzhī)趨化法，PMN或淋巴細(xì)胞作為指示細(xì)胞，以細(xì)胞趨化的程度來反映樣品中IL8活性水平。y242。,第五十一頁，共一百一十五頁。ngm243。oy236。,第五十頁，共一百一十五頁。jiē)殺傷靶細(xì)胞,細(xì)胞因子TNFα、TNFβ具有直接殺傷某些腫瘤細(xì)胞的作用，采用TNF敏感的細(xì)胞株如小鼠成纖維細(xì)胞株L929，以WEHI164亞克隆13（鼠纖維肉瘤細(xì)胞系）作為指示細(xì)胞，通過(tōnggu242。,第四十九頁，共一百一十五頁。ngch233。,第四十八頁，共一百一十五頁。)或增殖(zēngzh237。,第四十七頁，共一百一十五頁。)相應(yīng)的活性測定方法，如干擾素的抑制病毒感染效應(yīng)，腫瘤壞死因子對L929細(xì)胞的殺傷作用等。ng)檢測,利用一些細(xì)胞因子的功能特性，可建立(ji224。,第四十六頁，共一百一十五頁。,（1）依賴性細(xì)胞株,一些腫瘤細(xì)胞株必須依賴于細(xì)胞因子方能在體外增殖，如DTLL細(xì)胞株依賴IL2；FDCPL細(xì)胞株依賴于小鼠IL3；TF1細(xì)胞株依賴于人IL3和人GMCSF，因而可利用這些(zh232。)活性檢測法,測定細(xì)胞因子的生物學(xué)活性：刺激細(xì)胞增殖、維持細(xì)胞生長(shēngzhǎng)和存活、抑制細(xì)胞生長(shēngzhǎng)、溶解或殺滅細(xì)胞、抗病毒、促進細(xì)胞趨化、刺激細(xì)胞生成集落等活性； 指示細(xì)胞：多選用造血系統(tǒng)或淋巴系統(tǒng)細(xì)胞，最好用依賴性細(xì)胞株細(xì)胞； 顯示細(xì)胞反應(yīng)：用3H胸腺嘧啶核苷參入，或用四唑鹽轉(zhuǎn)化引致的顏色反應(yīng)。)高； 速度快、高通量； 線性關(guān)系好、線性范圍寬,第四十四頁，共一百一十五頁。,優(yōu)點(yōudiǎn),特異性好； 簡單、安全、自動化程度(ch233。,2） 2 △ △Ct法,第四十二頁，共一百一十五頁。,優(yōu)缺點,優(yōu)點：分析簡單，實驗優(yōu)化相對簡單； 缺點：對每一個(yī ɡ232。),目的基因定量結(jié)果,管家基因定量結(jié)果,相對值,待測樣品校正值,對照樣品校正值,=,=,校正值,=,目的基因定量結(jié)果,校正值,=,管家基因定量結(jié)果,目的基因定量結(jié)果,校正值,=,對照樣品校正值,待測樣品校正值,對照樣品校正值,=,待測樣品校正值,對照樣品校正值,第三十九頁，共一百一十五頁。 公式：,校正值(zh232。ngli224。,3）分析方法,雙標(biāo)準(zhǔn)(biāozhǔn)曲線法 2 △ △Ct法（Ct值比較法）,第三十八頁，共一百一十五頁。)文獻(xiàn)提供； 通過具體實驗。o)基因（管家基因）進行校正,第三十六頁，共一百一十五頁。,必須用內(nèi)對照(du236。,1）相對(xiāngdu236。,（3）qPCR結(jié)果分析—— 相對(xiāngdu236。ng)——融解曲線,第三十二頁，共一百一十五頁。,結(jié)果判定(p224。o)法原理,第三十頁，共一百一十五頁。,第二十九頁，共一百一十五頁。o)法,SYBR Green I是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域(qūy249。nɡ)標(biāo)記方法,非特異性熒光標(biāo)記： SYBR Green I 特異性熒光標(biāo)記： TaqMan Probe； 分子(fēnzǐ)信標(biāo),第二十八頁，共一百一十五頁。,（2）常用(ch225。njiū)表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。ngpǐn) Ct值=17（第17個循環(huán)時，熒光信號強度達(dá)到域值）,第二十六頁，共一百一十五頁。d236。) C代表Cycle（循環(huán)數(shù)） t代表thresho
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