流式細(xì)胞術(shù)的樣品制備-文庫吧資料
2025-05-18 07:14本頁面
【正文】 染液溴化乙啶 (EB)或碘化丙啶 (PI)1ml，置 04℃ 冰箱 30分鐘，經(jīng) 300目尼龍網(wǎng)過濾后上機(jī)檢測。 ⑧收集細(xì)胞懸液，離心沉淀 1500prm，以生理鹽水漂洗 12次，離心沉淀 1500prm，再以生理鹽水漂洗 12次，離心沉淀 500800prm，去碎片。 石蠟包埋組織單細(xì)胞懸液的制備 ⑥ 消化 30分鐘后，立即加入生理鹽水終止消化。 ④水化：依次加入 100%、 95%、 70%、 50%梯度的酒精 5ml，每步 10分鐘，去乙醇，加入蒸餾水 35ml， 10分鐘后棄之。 ②將切取的組織片放入試管中。 Ⅴ 在使用酶學(xué)方法時(shí)，要重視酶的選用，如含有大量結(jié)締組織的腫瘤，如食管癌、乳癌、皮膚癌等，用膠原酶為好，因?yàn)槟z原酶具有在 Ca2＋ 、 Mg 2＋ 存在或在血清狀態(tài)下不發(fā)生活性降低的特征。 Ⅲ 酶學(xué)法要注意條件的選擇和影響因素，要注意酶的溶劑，消化時(shí)間、 pH值、濃度等方面對酶消化法的影響。 注意事項(xiàng)： Ⅰ 新鮮組織標(biāo)本應(yīng)及時(shí)進(jìn)行保存，以免組織在室溫下放置時(shí)間過長，造成細(xì)胞自溶導(dǎo)致 DNA降解，影響 FCM測定結(jié)果。 機(jī)械法常常造成嚴(yán)重的細(xì)胞損傷，較低的細(xì)胞產(chǎn)量，為使細(xì)胞碎片不影響 FCM檢測結(jié)果，需采用適當(dāng)?shù)姆椒ǔニ槠虮M量減少碎片。 ⑤ 70%乙醇固定置冰箱中被檢。 ③加入胰酶 +EDTA液 510ml，在 37℃ 恒溫水浴 30分鐘，間斷振蕩 35次。 實(shí)驗(yàn)步驟： ①將組織切成薄片放入試管。 ②胰酶加 EDTA配制 胰酶 +PBS()200ml，濃度 %，+PBS()200ml，濃度 %。 試劑配制： ① %EDTA配制 ，加入 Hank180。 ⑤ 收集細(xì)胞懸液，并經(jīng) 300目尼龍網(wǎng)過濾，離心沉淀 500800prm， 12分鐘，再用生理鹽水洗三次，離心沉淀。 ③ 轉(zhuǎn)動研棒，研至勻漿即可。 ?研磨法 準(zhǔn)備一只 70ml組織研磨器 ① 將組織剪碎至小塊。 ③ 用 300目的 尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液除去大的團(tuán)塊 ④ 收集細(xì)胞懸液，離心沉淀 1000prm， 5分鐘。 ?網(wǎng)搓法： ① 將 100目銅網(wǎng)扎在小燒杯上。 ⑥ 以 300目尼龍網(wǎng)過濾除去細(xì)胞團(tuán)塊。 ④ 用吸管吸取組織勻漿，先以 100目尼龍網(wǎng)過濾到試管中。 ② 用剪刀將組織剪至勻漿狀。 ⒉ 機(jī)械法 機(jī)械法分裂實(shí)體組織包括：用剪刀剪碎或用鋒利的解剖刀剁碎，用勻漿器勻漿，用細(xì)注射針頭抽吸細(xì)胞以分散細(xì)胞，采用網(wǎng)搓法同樣也能獲得大量的細(xì)胞，機(jī)械法易造成細(xì)胞懸液中細(xì)胞碎片，所以機(jī)械法常與其他方法配合使用。 ④ 終止消化，收集細(xì)胞懸液，以尼龍網(wǎng) (200目 )過濾，除去大團(tuán)塊，以低速離心除去細(xì)胞碎片。 ③ 一般消化 2030分鐘 (恒溫 37186。 酶學(xué)方法的一般程序：
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