流式細(xì)胞術(shù)的樣品制備(完整版)
【正文】 導(dǎo)致細(xì)胞成活率降低，細(xì)胞產(chǎn)額較低，細(xì)胞碎片和細(xì)胞叢結(jié)的量不穩(wěn)定，因此，化學(xué)試劑處理方法不單獨(dú)使用，可與其他方法聯(lián)合使用。s液 100ml，封裝高壓消毒，置 04℃ 保存。 ⑤ 70%乙醇固定，置 4℃ 冰箱備用。 ③ 加入 10ml生理鹽水。 ② 將選好的酶溶液 12ml加入盛有被消化組織的試管中。 二、實(shí)體組織單分散細(xì)胞的制備 ㈠新鮮實(shí)體組織 新鮮實(shí)體組織是手術(shù)或活檢后根據(jù)檢測(cè)目的而采取的樣品，此樣品應(yīng)及時(shí)進(jìn)行適當(dāng)?shù)谋４嫣幚?，如及時(shí)用固定劑或低溫對(duì)組織進(jìn)行保存，以避免由于室溫過高、放置時(shí)間過長而造成組織自溶，影響檢測(cè)結(jié)果。流式細(xì)胞術(shù)的樣品制備 FCM的樣品制備包括單分散細(xì)胞懸液制備技術(shù)，細(xì)胞生物學(xué)特征標(biāo)記技術(shù)及熒光染色技術(shù)， FCM是對(duì)細(xì)胞或細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)和某些功能進(jìn)行定量測(cè)定，并可以根據(jù)細(xì)胞亞群的特點(diǎn)性質(zhì)對(duì)其進(jìn)行分類的技術(shù)。 新鮮實(shí)體組織單細(xì)胞懸液制備方法如下 ： ⒈酶消化法 ⒉機(jī)械法 ?剪碎法 ?網(wǎng)搓法 ?研磨法 ⒊化學(xué)試劑處理法 ⒈ 酶消化法 酶對(duì)實(shí)體組織分散作用原理主要有三方面： ﹡ 一是可以破壞組織間的膠原。 ③ 一般消化 2030分鐘 (恒溫 37186。 ④ 用吸管吸取組織勻漿，先以 100目尼龍網(wǎng)過濾到試管中。 ?研磨法 準(zhǔn)備一只 70ml組織研磨器 ① 將組織剪碎至小塊。 ②胰酶加 EDTA配制 胰酶 +PBS()200ml，濃度 %，+PBS()200ml，濃度 %。 機(jī)械法常常造成嚴(yán)重的細(xì)胞損傷，較低的細(xì)胞產(chǎn)量，為使細(xì)胞碎片不影響 FCM檢測(cè)結(jié)果，需采用適當(dāng)?shù)姆椒ǔニ槠虮M量減少碎片。 ②將切取的組織片放入試管中。 ⑩單細(xì)胞樣品 1 106細(xì)胞 /ml，加入熒光染液溴化乙啶 (EB)或碘化丙啶 (PI)1ml，置 04℃ 冰箱 30分鐘，經(jīng) 300目尼龍網(wǎng)過濾后上機(jī)檢測(cè)。 ⒋用吸管將上層與中層之間的淋巴細(xì)胞吸出，收集到另一支離心管，用生理鹽水稀釋至 10ml，離心洗滌 2次，每次均以 1500prm, 10分鐘，棄上清后即得到純度較高的淋巴細(xì)胞，但可有少量的單核細(xì)胞。 ,放入培養(yǎng)瓶內(nèi) ,將稀釋血加入 培養(yǎng)液中 ,混勻 ,與培養(yǎng)瓶接觸面要大。 ,以 1500prm離心沉淀 ,用生理鹽水洗滌 2次 ,每次 5分鐘 ,棄上清后加入 70%乙醇 3ml固定備檢 。 ㈣ 內(nèi)鏡 刷檢 樣品單細(xì)胞懸液制備 10ml鹽水中洗脫 ， 收集懸液進(jìn)入試管 ,以 1500prm離心沉淀 ， 再以生理鹽水漂洗 23次 ， 每次500800prm離心沉淀 2分鐘 ， 棄上清 。 %冷乙醇固定 ， 置于冰箱備檢 。 1X106/ml,可進(jìn)行標(biāo)記染
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