20xx年醫(yī)學(xué)專題—流式細(xì)胞術(shù)的原理和應(yīng)用-在線瀏覽
2024-11-15 05:41本頁面
【正文】 一百一十五頁。n),第二十二頁，共一百一十五頁。 d236。 SDcycle 315 意義：大于熒光背景值和陰性對照熒光最高值，進(jìn)入(j236。)指數(shù)期的最初階段； 真正熒光信號：熒光信號大于閾值,第二十三頁，共一百一十五頁。ngguāng)閾值（threshold）,第二十四頁，共一百一十五頁。sh249。,Ct值的確定(qu232。ng),橫坐標(biāo)：PCR循環(huán)數(shù) 縱坐標(biāo)：熒光信號強(qiáng) 度 黑線：熒光域值 紅線：無模板 域值下一 直線 綠線 ：樣品(y224。,Ct值與起始(qǐ shǐ)模板的關(guān)系,研究(y225。 利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,第二十七頁，共一百一十五頁。nɡ y242。,SYBR Green I染料(rǎnli224。)的具有綠色激發(fā)波長的染料。,SYBR Green I染料(rǎnli224。,注意事項(xiàng),因?yàn)镾YBR Green I可以與所有(suǒyǒu)dsDNA結(jié)合而激發(fā)熒光，因此，如果反應(yīng)體系中有非特異性擴(kuò)增或引物二聚體，也可以同時被檢測，將導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確； 關(guān)鍵：設(shè)計(jì)特異性引物！,第三十一頁，共一百一十五頁。nd236。,第三十三頁，共一百一十五頁。)定量解析,第三十四頁，共一百一十五頁。)定量的必要性,第三十五頁，共一百一十五頁。zh224。,2）管家基因篩選(shāixuǎn),管家基因：維持細(xì)胞生命活動代謝所必須的基因，如GAPDH, betaActin, 18s rRNA等； 篩選方法： 根據(jù)(gēnj249。,第三十七頁，共一百一十五頁。,1）雙標(biāo)準(zhǔn)(biāozhǔn)曲線法,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對對照樣品、待測樣品目的基因及管家基因進(jìn)行定量(d236。ng)，然后根據(jù)公式計(jì)算相對值，即為相對表達(dá)量。nɡ zh237。,第四十頁，共一百一十五頁。)基因，每一輪實(shí)驗(yàn)均需要做標(biāo)準(zhǔn)曲線； 應(yīng)用：基因表達(dá)調(diào)控研究,第四十一頁，共一百一十五頁。,2 △ △Ct法：假設(shè)目的基因、對照基因擴(kuò)增效率均是100% △Ct（處理前/對照組）=1817=1 △Ct（處理后/實(shí)驗(yàn)組）=1617.4=1.4 △ △ Ct= △Ct（處理后）△Ct（處理前)=2.4 比率(bǐlǜ)（處理后/處理前）= 2 △ △Ct=2 2.4 =5.3 結(jié)論：JUN處理后表達(dá)水平是處理前的5.3倍 修正：擴(kuò)增效率不是1，而是E， 2 △ △Ct可修正為（1+E） △ △Ct,第四十三頁，共一百一十五頁。ngd249。,2. 生物(shēngw249。,第四十五頁，共一百一十五頁。xiē)依賴細(xì)胞株檢測相應(yīng)的細(xì)胞因子； 優(yōu)點(diǎn)：敏感性高，特異性強(qiáng)； 缺點(diǎn)：應(yīng)用有限。,（2）功能(gōngn233。nl236。 優(yōu)點(diǎn)：敏感性高； 缺點(diǎn)：特異性不夠，容易受一些擾因素的影響。,A. 增殖(zēngzh237。)抑制法,其基本原理是應(yīng)用某一細(xì)胞因子能特異地刺激或抑制某些(mǒu xiē)指示細(xì)胞的增殖，通過3HTdR摻入或MTT法顯色，反映待檢細(xì)胞因子的活性水平。,B. 集落形成(x237。ng)法,其基本原理是應(yīng)用骨髓干細(xì)胞體外半固體培養(yǎng)系統(tǒng)，根據(jù)不同造血因子能誘導(dǎo)干細(xì)胞或定向造血祖細(xì)胞形成某一種(yī zhǒnɡ)或某些種類細(xì)胞的集落，通過對形成集落形態(tài)學(xué)、酶學(xué)鑒定，計(jì)算不同種類集落形成的數(shù)量和比例，反映待測標(biāo)本中CSF的種類和活性水平。,C. 直接(zh237。)3HTdR釋放法或染料染色等可檢測待檢樣品中TNF的活性水平。,D. 抗病毒效應(yīng)(xi224。ng),靶細(xì)胞受某些病毒感染后可發(fā)生明顯病變和死亡，干擾素可保護(hù)靶細(xì)胞免受病毒的攻擊； 常用的病毒是水皰性口炎病毒（vesicular stomatitis virus, VSV），敏感的指示細(xì)胞為喉癌的上皮細(xì)胞株Hep2和羊膜(y225。)的上皮細(xì)胞WISH，通過干擾素（IFNα、IFNβ、IFNγ）抑制病毒致病變的程度，計(jì)算出待測樣品中IFN的活性單位。,E. 趨化作用(zu242。ng),IL8對多形核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞具有趨化作用，可用小室法或軟瓊脂(qi243。,第五十二頁，共一百一十五頁。ngtǐ)形成法,IL6可在體外刺激某些B淋巴細(xì)胞系產(chǎn)生(chǎnshēng)和分泌免疫球蛋白； 指示細(xì)胞：分泌IgG的ARH7CESS 分泌IgM的SKW6.CL4 方法：在一定條件下，待檢樣品中IL6水平與培養(yǎng)細(xì)胞上清IgG或IgM水平正相關(guān)，通過標(biāo)準(zhǔn)IL6的對照可推算出待檢樣品中IL6的活性。,IL2的誘生及生物(shēngw249。,一般(yībān)方法,細(xì)胞因子敏感的細(xì)胞株 細(xì)胞因子的標(biāo)準(zhǔn)品及待測品 指示劑：MTT，3HTdR 酶聯(lián)免疫吸附測定儀測定OD值 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(qūxi224。,稀釋(xīsh236。,對生物學(xué)活性測定法的評價(p237。),優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高； 測定的是有生物活性的細(xì)胞因子 缺點(diǎn)：維持靶細(xì)胞株，操作繁雜和難定量(d236。ng) 特異性差 實(shí)驗(yàn)周期較長 易受其它因素的影響,第五十七頁，共一百一十五頁。 基本原理是細(xì)胞因子（或受體）與相應(yīng)的特異性抗體（單克隆抗體或多克隆抗體）結(jié)合，通過同位素、熒光素或酶等標(biāo)記技術(shù)加以放大(f224。)和顯示，從而定性或定量顯示細(xì)胞因子（或受體）的水平。,Radioimmunoassay Immunofluorescence 酶免疫分析 (EIA)：ELISA：體液中的細(xì)胞因子 免疫組織化學(xué) ELISPOT：分泌(fēnm236。,60,第六十頁，共一百一十五頁。)方法,測定的是細(xì)胞因子的前體分子，是單一(dānyī)細(xì)胞行為； 一般要用先活化細(xì)胞，使之合成欲測細(xì)胞因子。,活化劑,活化(hu243。)T細(xì)胞：除特異性抗原外，主要植物血凝素(PHA)、巴豆酯(PMA)、離子霉素（ionomycin）、鈣離子載體A2318T細(xì)胞受體抗體或CD3的抗體等； 活化B細(xì)胞：特異性抗原，脂多糖（LPS）、金黃色葡萄球菌腸內(nèi)毒素A、B細(xì)胞受體抗體； 活化單核細(xì)胞：LPS和某些細(xì)胞因子。,人外周血單個核細(xì)胞IL17A流式檢測
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