【正文】 式細胞儀,第十四頁，共九十四頁。)和陽性細胞數(shù)。,I 流式細胞儀的基本原理,免疫熒光染色常用方法： 直接免疫熒光法：用一種（單色）或者多種（多色）熒光素標記的McAb染色細胞后測量其熒光強度(qi225。目前，流式細胞術有單色、雙色、三色、四色、五色熒光分析(fēnxī)，對細胞的分析(fēnxī)更加精密、深入。,I 流式細胞儀的基本原理,熒光染色原理 免疫熒光染色：細胞膜上或細胞內(nèi)的抗原分子與相應的熒光素標記McAb作用一定時間后形成帶有熒光素的抗原抗體復合物，經(jīng)激光激發(fā)后發(fā)出特定的熒光，其熒光強度與被測定抗原分子含量呈比例關系，由此可求得被測細胞與標記McAb相對應抗原的表達量和陽性細胞百分比。 帶有電荷的液滴向下落入偏轉(zhuǎn)板間的靜電場時，依據(jù)所帶電荷符號向左或向右偏轉(zhuǎn)，落入指定的收集器內(nèi)，不帶電荷的液滴不發(fā)生偏轉(zhuǎn)，垂直落入廢液槽中排出，從而實現(xiàn)細胞的分類。 在細胞形成液滴以前，各類細胞的特性已在測量區(qū)被測定并儲存。nd242。nd242。,示意圖,11,流式細胞儀,第十一頁，共九十四頁。計算機通過相應的軟件儲存、計算、分析，就可以得到細胞的大小(d224。這些信號分別被成90℃角方向放置的光電倍增熒光檢測器和前向角放置的光電二極管檢測器接收，經(jīng)過轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換為電子信號。 在氣體壓力的作用下，懸浮在樣品管中的單細胞懸液形成樣品流垂直進入流式細胞儀的流動室，流動室充滿鞘液，在鞘液的約束下，細胞排列成單列由流動室的噴嘴噴出，成為細胞液柱， 液柱與水平方向的入射激光束垂直相交，相交點稱為測量區(qū)。ng) 流式細胞儀的應用 流式細胞儀實例,10,流式細胞儀,第十頁，共九十四頁。x237。,9,流式細胞儀,第九頁，共九十四頁。前者的激光光斑為橢圓形，光斑直徑大于被檢細胞體積。 根據(jù)結構不同，可分為一般流式細胞儀（零分辨率流式細胞儀）和狹縫掃描(sǎomi225。i),流式細胞儀的分類 根據(jù)功能不同，可分為臨床型和綜合型（科研型）。,8,流式細胞儀,第八頁，共九十四頁。 多參數(shù)：可同時定量檢測單個細胞的DNA等多個參數(shù)。 高精度：在細胞懸液中測量細胞，比其他分析技術的變異系數(shù)更小，分辨率高。tā)細胞分析技術相比，有如下特點： 高速度：每秒可檢測1 000~5 000個細胞。,流式細胞儀特點(t232。)使用，使之成為實驗室里更常用的儀器。 更加普及化是指儀器更易于(y236。,流 式 細 胞 儀發(fā)展(fāzhǎn)歷史,目前，流式細胞儀同時朝著更加專業(yè)化和更加普及化的兩個不同的方向發(fā)展。 20世紀90年代，與之配套的標本制備儀和自動進樣器的問世，以及適合臨床應用的單克隆抗體的增加，使流式細胞儀逐漸從科研單位進入醫(yī)院的中心實驗室和檢驗科，成為現(xiàn)代化的臨床檢驗儀器的一部分。b232。,5,流式細胞儀,第五頁，共九十四頁。nghǎo)的基礎。,4,流式細胞儀,第四頁，共九十四頁。 1969年，F(xiàn)ulwyler利用靜電墨水噴射液滴偏轉(zhuǎn)技術，建立了流式細胞分選術。ngw233。,流 式 細 胞 儀發(fā)展(fāzhǎn)歷史,1967年，Van Dilla和Los Alamos采用了層流流動室和氬激光器，開發(fā)出了液流束、照明光軸、檢測系統(tǒng)三者相互垂直的流式細胞儀。奠定了多參數(shù)流式細胞測量的基礎。 1965年，Kamentsky用紫外吸收和可見光散射兩個參數(shù)同時測量未染色細胞，給出細胞中核酸的含量和細胞大小(d224。,流 式 細 胞 儀發(fā)展(fāzhǎn)歷史,流式細胞儀的發(fā)展歷史 1934年，Moldavan使懸浮的紅細胞從一個毛細玻璃管中流過，每個通過的細胞可被一個光電裝置記錄下來。 流式細胞術綜合應用了激光技術、流體力學、細胞生物化學技術、熒光標記技術、單克隆抗體技術、分子生物學技術、計算機技術及臨床醫(yī)學等多門技術。同時依賴(yīl224。,1,流式細胞儀,第一頁，共九十四頁。jiāo)細胞、聚集細胞等。流 式 細 胞 儀,流式細胞儀（flow cytometer，F(xiàn)CM）是以激光為光源、檢測生物學顆粒理化性質(zhì)的儀器。 生物學顆粒包括大的免疫復合物、DNA、 RNA、染色體、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)體、細胞器、病毒顆粒、細菌、真菌、真核細胞、雜交(z225。 理化性質(zhì)包括細胞大小、細胞形狀、細胞膜完整性、胞漿顆?；潭?、DNA含量、總蛋白含量、酶活性等。,流 式 細 胞 儀流式細胞術,流式細胞術（flow cytometry，F(xiàn)CM） 流式細胞術是應用流式細胞儀對懸浮液中的細胞或細胞器進行快速測量和多參數(shù)檢測的細胞分析技術。i)測量到的參數(shù)還可以用物理的方法將一個群體中的細胞亞群分選出來，即流式細胞分選術（cell sorting）。,2,流式細胞儀,第二頁，共九十四頁。這就是流式細胞儀的雛形。xiǎo)。,3,流式細胞儀,第三頁，共九十四頁。這成為(ch233。i)目前各種流式細胞儀的基礎。 Ehrlich和Wheeless利用飛點掃描技術和縫掃描技術使零分辨率的流式細胞儀變成了低分辨率的流式細胞儀。,流 式 細 胞 儀發(fā)展(fāzhǎn)歷史,20世紀70年代，隨著Kohler和Milstein成功提出了單克隆抗體技術和熒光標記技術，為特異研究和分析細胞奠定了良好(li225。 1973年，美國BD公司和美國斯坦福大學合作，研制開發(fā)并生產(chǎn)了世界上第一臺商用流式細胞儀FACS I。,流 式 細 胞 儀發(fā)展(fāzhǎn)歷史,20世紀80年代，流式細胞儀的數(shù)據(jù)采集、存儲、顯示、分析日趨完善，隨著樣品制備(zh236。i)方法的增加，新的熒光染料和細胞標記物的出現(xiàn)，使流式細胞儀的應用范圍逐漸擴大。,6,流式細胞儀,第六頁，共九十四頁。 更加專業(yè)化是指儀器更精密、更靈敏地進行更多參數(shù)的分析和更快、更純地進行細胞分選。y,7,流式細胞儀,第七頁，共九十四頁。diǎn),FCM與其他(q237。 高靈敏度：每個細胞只要帶有1 000~3 000個熒光分子就能檢出，兩個細胞之間有5%的差別就可區(qū)分出來，光散射的靈敏度為0.3um。 高純度：分選細胞的純度可大于99%以上。 在適當?shù)臈l件，可對活細胞進行無害性分析和分選。,流式細胞儀分類(fēn l232。 根據(jù)有無細胞分選功能，可分為流式細胞分析分選儀和流式細胞分析儀。o)流式細胞儀（高分辨率流式細胞儀）。后者激光光束為一條線狀扁平光斑，直徑在3~5um。,流 式 細 胞 儀學習(xu233。)內(nèi)容,流式細胞儀的基本原理 流式細胞儀的基本結構 流式細胞儀的性能指標 流式細胞儀的使用(shǐy242。,I 流式細胞儀的基本原理,基本原理： 將懸浮分散的單細胞懸液，經(jīng)特異性熒光染料染色 后，放入樣品管。通過測量區(qū)的細胞受激光照射后發(fā)出熒光，同時產(chǎn)生光散射。 電子信號經(jīng)模/數(shù)轉(zhuǎn)換輸入計算機。xiǎo)和活性、核酸含量等理化指標。,I 流式細胞儀的基本原理,細胞分選原理： 在壓電晶體上加上頻率為30kHz的信號，使之產(chǎn)生同頻率的機械振動(zh232。ng)，流動室也隨之振動(zh232。ng)，這樣通過測量區(qū)的液柱斷裂成一連串均勻的液滴。如果其特性與要分選的細胞相同時，儀器就在這類細胞形成液滴時給該液滴充與指定的電荷，這樣，當被選定的細胞形成液滴時就帶有特定的電荷，未被選定的細胞形成的細胞液滴及不含細胞的空白液滴不被充電，也就不帶電荷。,12,流式細胞儀,第十二頁，共九十四頁。常用的熒光染料有異硫氰酸熒光素（FITC）、藻紅蛋白（PE）、別藻青蛋白（APC）和Perdinin葉綠素（PerCP）等，經(jīng)488nm激光激發(fā)后其發(fā)射熒光光譜有差別，因而可將其用于標記不同的McAb進行單色或多色免疫熒光染色。,13,流式細胞儀,第十三頁，共九十四頁。ngd249。 間接免疫熒光法：用一種McAb與細胞作用后，洗去未結合McAb，再加入熒光素標記的第二抗體（如羊抗鼠IgGF