20xx年醫(yī)學(xué)專題—第11章流式細胞技術(shù)和流式細胞儀(編輯修改稿)
2024-11-19 05:16 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 nm之間，發(fā)射波則在450nm處。（五）異硫氰酸熒光素染色以異硫氰酸熒光素（Fluorescein Isothiocyante，F(xiàn)ITC）染色蛋白質(zhì)。： FITC用含40 mg/L ～ mg/L濃度。：(1)染色前用終濃度70%乙醇固定細胞，至少18小時。(2)離心固定細胞，棄去固定液。(3)室溫下用FIFC染色細胞蛋白，30分鐘。(4)流式細胞儀分析，使用氬激光，激發(fā)波長488nm，熒光發(fā)射波長515～535nm。也可于固定細胞中，以18 mg/L (%檸檬酸鹽配制) mg/L FIFC(含40 mg/L RNase，PBS配制)染色20分鐘以上可對DNA和蛋白質(zhì)雙重染色，分別呈現(xiàn)紅色熒光（DNA）和綠色熒光（蛋白質(zhì)）。（六）若丹明染色若丹明標(biāo)記單克隆抗體的應(yīng)用該技術(shù)既可用于檢測帶有特異性膜抗原的細胞，可用若丹明標(biāo)記單克隆抗體處理上述細胞；也可用于測定胞漿中的蛋白質(zhì)(如凋亡BCL2蛋白，抗病毒蛋白MXA等)。：用磷酸鹽緩沖液Eagle39。s %疊氮鈉、2%牛血清。為判定FITC抗體的最適度的稀釋濃度，向微量滴定板的細胞中加入50μL不同濃度的稀釋液，再以熒光顯微鏡確認最佳染色濃度。使用抗人LEUI抗體分析時，應(yīng)稀釋成5 mg/L或 mg/L。無論鼠或人細胞在2107濃度時其存活率應(yīng)在90%以上。：(1)于微量滴定板加入50μL若丹明標(biāo)記的抗體，再加入50μL細胞懸液，混勻。(2)冰浴45分鐘，離心滴定板（1500r/min 10分鐘）。(3)棄上清，以培養(yǎng)基100μL洗滌細胞沉淀2次，每次洗滌后用1500r/min 10分鐘，棄上清。(4)以1ml預(yù)冷的培養(yǎng)基配成1106細胞/mL的已染色細胞懸液，進樣前持續(xù)保持冷環(huán)境(4℃)。 （七）光輝霉素和PI的雙標(biāo)記DNA染色在熒光抗生素光輝霉素和PI聯(lián)合染色過程中，光輝霉素的供體分子被PI的受體分子接受產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移，該染色技術(shù)主要用于實體腫瘤組織，精子細胞及婦科標(biāo)本，同時也適用于體外培養(yǎng)的細胞。，若用70%乙醇固定可保存一周。2．以PI/光輝霉素染色，4℃ 1小時（PI為10 mg/L、光輝霉素為10 mg/L）。3．染色后進樣，以100W汞燈作為激光光源，使用BG123nm阻斷濾片，疊加K590型高通濾法。（八）PI和FITC對DNA與癌基因探針雙標(biāo)記測定1. 說明：這種測定是先用癌基因探針按間接免疫熒光染色法標(biāo)記癌基因表達產(chǎn)物，然后用PI標(biāo)記
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