【文章內容簡介】 ，必要時需調節(jié) FL2%FL1， FL1%FL2（若 3色樣本，必要時需調節(jié) FL2%FL FL1%FL FL3%FL FL2%FL3的 補償）。 21. High RUN，換上單染 CD3FITC管。點擊 Acquisition Control窗口中的 Acquire。調節(jié) FL2%FL1使 FITC陽性細胞在 FL1/FL2散點圖的右下象限。補償調節(jié)可通過點擊 ??來選擇或直接拖動滑標上下移動。調節(jié)完畢，點擊 Acquisition Control窗口中的 Pause。 22. 移去單染 CD3，換上單染 CD19PE管。點擊Acquisition Control窗口中的 Restart。調節(jié) FL1%FL2使 PE+細胞在 FL1/FL2散點圖的左上象限。調節(jié)完畢，點擊 Acquisition Control窗口中的 Pause。 FACS101 Handbook 12 – 23. 最后以 CD3FITC/CD19PE雙染樣本上機，點擊 Acquisition Control窗口中的 Restart，確定三群細胞工整垂直。當您已完成 2色熒光之光譜重迭時，點擊 Acquisition Control窗口中的 Pause、 Abort。 24. 移去樣本管，換上 dH2O管，讓儀器暫且處于 Standby狀態(tài) 。關閉Compensation窗口。您已完成 2色熒光之最適 化。 決定儲存細胞總數 25. 預設之「 儲存細胞總數 」為 10000。如需修改，從Acquire菜單中選擇 Acquisition amp。 Storage，并在出現的窗口功，確認 「 Collection Criteria」從 10000 of All，再點擊 OK。 FACS101 Handbook 13 – 26. 找個檔案匣準備儲存數據 。 從 Acquire 菜單中選擇 Parameter Description，出現 Parameter Description對話方框。點擊 Folder，并在隨后出現之對話方 框，選擇「 Your Folder」或新建活頁夾，點擊此對話方框的 Select ‘Your Folder‘。 27. 命名即將儲存之文件名：點擊 Parameter Description對話方框的 File，出現文件名編輯窗口。在 Custom Prefix中：輸入文件名 20202031，點擊此對話方框的 OK。日期為最常用之文件名系統(tǒng)。 28. Optional：如有需要，可選擇或在 P1P5后的空格中輸入相關參數名。如P1： Size, P2： Granularity, P3：CD3 FITC。 輸入參數名會存入實驗檔案中，顯示在圖譜上。 計數器 Counters 29. 從 Acquire 菜單中選擇 Counters. 窗口會顯示樣品分析速率、與總數進度 。 收集實驗數據 30. 你可以開始 收集實驗數據了 。 HIGH RUN，將第一管樣品放到檢測區(qū)，在Acquisition Control窗口中，將 ? Setup 改成 ? Setup，此時 CellQuest會自動顯示 Your Folder： 。點擊“ Acquire‖ 便可啟動樣品之分析測定與數據 儲存。當計算機成功地收取足夠數據，會自動儲存數據文件 ，并會以“嘟”聲告知， CellQuest會自動升冪附加檔名成。等待下一指示。 31. 你可以 換上下一管樣品，點擊“ Acquire‖ 啟動樣品之分析測定與數據儲存?？衫^續(xù)分析直到所有檢品都分析完畢。 FACS101 Handbook 14 – ： 32. 不建議長期使用硬盤儲存數據 數據，可考慮以燒光盤 （如配有 CDRW）、口袋硬盤（ Flash Drive）來備份大量實驗數據，以免占用原有硬盤的內存， 影響數據處理速度。可將備份后之數據，拿到另一蘋果計算機或個人 PC進行離機分析。 33. 確認所有檔案皆己備份后，以鼠標圈選欲刪除 數據 ，將其拖拉至 Trash筒。 退出軟件 34. 檢品分析完畢后，記得從屏幕上方 File 指令欄選擇 Save As，儲存實驗文件，以備日后使用，不需每次重新編輯。 35. 從屏幕上方 Cytometer 指令欄，選擇 Instrument Setting，出現 Instrument Setting窗口。點系 print打印此次實驗條件，可貼入實驗筆記留底，再點擊 Save以儲存此一實驗的儀器條件，供日后再使用。點系 SAVE后會出現文件保存對話方框，選擇文件目錄及文件名（例： Your Folder： /Your Setting1），點擊Save。點擊 Done。 36. 檢品分析完畢后，用鼠標從屏幕上方 Acquire 指令欄中，選取 Disconnect to Cytometer 以斷絕計算機與儀器間之聯(lián)機。之后如不分析數據，您可退出軟件“ File” ?“ Quit” (遇有選項永遠選擇“ Don?t save” )，進行關機程序。 管路清洗 37. 以 2 ml 10％ 漂白水取代樣品，將樣品架置于左位以外管吸除約 1 ml，再將樣品架置于中位 HI RUN 十分鐘。改用 2 ml DI water。重復上述程序，樣品架上留約 1 ml DI water 。按 STANDBY五分鐘。 關主機、關計算機 FACS101 Handbook 15 – 四、數據分析 FCS list mode 數據文件： 說明： FCS list mode 數據文件 是流式細胞儀的標準格式檔案（ ）。該文件含有從流式細胞儀收取的平均 10,000個細胞數的資料，含有 4~6個參數。一般軟件無法打開 list mode數據文件，需藉助如 CellQuest, WinList, WinMDI, 等 Flow 分析軟件 ，才可開啟、繪圖、并進行分析統(tǒng)計。 開啟一 CellQuest實驗文件 1. 從屏幕上方 File 菜單中選擇 New。桌面會出現一 ‘Untitled‘ 實驗文件，可點擊實驗文件的右上角的放大鈕，將實驗文件窗口放大。 （雙色） 2. 從工具板中點擊散點圖圖示。在實驗文件的空白區(qū)點擊，然后拖動對角線至適當大小。 Plot 拖曳完成后可以在右方看到 Dot Plot對話框。 FACS101 Handbook 16 – 3. 在 Dot Plot方框中， Plot Source應預設為 Analysis，可 點擊 Select File 鈕，并用隨后之方框來開啟 預 存之 Sample Files，它們的路徑位于 Mac HD： BD Applications： CellQuest Folder： Sample Files。連續(xù)雙擊鼠標來打開次目錄，找到檔案后，點擊 Open來開啟 NORM001 檔案。 X 與 Y 參數項會出現默認值 —FSCH 256 與 SSCH 256， 在 Color方框 中點擊 Multicolor Gating，確認無誤之后，點擊 OK 便完成了一個 NORM001 的 FSC /SSC散點圖。 4. 工具板中選擇多角形區(qū)隔工具，將 Cursor 移至 FSC/SSC散點圖上，并沿著淋巴球聚落周邊畫出范圍，連點擊兩次可關閉該區(qū)域。你已完成 R1區(qū)域的界定，我們將以此區(qū)域來圈選淋巴細胞。 (如果要刪除 R1區(qū)域，您可以在工具欄中點選 Gates → Region list，以鼠標點選 R1，再按 Delete 鍵刪除 R1 區(qū)域。刪除 R1區(qū)域后，可用繪圖工具板，重畫 R1。 ) 5. 從 Plots菜單中選擇 Dot Plot可復制一個同樣大小的散點圖，屏幕上會出現一 Dot Plot