【正文】 n list，以鼠標(biāo)點選 R1，再按 Delete 鍵刪除 R1 區(qū)域。 （雙色） 2. 從工具板中點擊散點圖圖示。改用 2 ml DI water。 退出軟件 34. 檢品分析完畢后，記得從屏幕上方 File 指令欄選擇 Save As，儲存實驗文件，以備日后使用，不需每次重新編輯。點擊“ Acquire‖ 便可啟動樣品之分析測定與數(shù)據(jù) 儲存。在 Custom Prefix中：輸入文件名 20202031，點擊此對話方框的 OK。您已完成 2色熒光之最適 化。 22. 移去單染 CD3，換上單染 CD19PE管。移去陰性對照管， 關(guān)閉Detector/Amps、 Threshold窗口，我們已設(shè)定好有意義細胞群之自體熒光。 17. 選取希望 Gate的 FL1/FL2散點圖， 從 Plots菜單中選擇 Format dot plot。調(diào)節(jié) FSC/SSC圖的原則，在于能得到一獨立離散的細胞族群，該細胞群不與其它族群、細胞碎片有重迭現(xiàn)象。將其拖至空白區(qū)。 儀器設(shè)置文件 注意： 實驗數(shù)據(jù)質(zhì)量，取決于最適化儀器設(shè)定文件。修改動作為輕擊 圖譜上 X和 Y軸參數(shù) ，并 依需要選擇之（ FSC：細胞大小， SSC：細胞折射率， FL1： FITC綠色熒光， FL2： PE橙色熒光，F(xiàn)L3： PerCP紅色熒光 ）。 6. 在出現(xiàn)的散點圖對話方框中點擊 Plot Source，選擇 Acquisition (收取 ) ，確認 X和 Y軸參數(shù)預(yù)設(shè)為 FSCH 102 SSCH 1024。 3. 儀器會對 鞘流液筒打氣加壓，請確認筒蓋確實旋緊。 （ 1） Negative Control（不加任何抗體）。） 7. 倒掉廢液，并回填 200 ml漂白水。 10. 可開始分析樣品。 2. 開啟其它周邊配備電源，如打印機及 MO機。 FACS101 Handbook 4 – Macintosh計算機與打印機： 準(zhǔn)備您的細胞樣品 1. 理想樣品濃度調(diào)至 110 X 105 cells/ml？一般實驗只需 ml的 樣品。 ? 進樣針：是一根不銹鋼管，將細胞從樣本針中吸入流動室。筒上裝有液面感應(yīng)器，廢液盛滿時，儀器軟件上會有顯示。 4. 儲液箱抽屜： 在主機左下方之儲液箱抽屜。 如需要 免疫 熒光染色 方法， 請至本公司網(wǎng)站下載 。 一、 BD FACSCalibur 基本結(jié)構(gòu) ： 1. 電源開關(guān)：在 BD FACSCalibur儀器右側(cè)下方，先啟動儀器本體，再打開 計算機?？上蚯袄_，內(nèi)含鞘流液筒、廢液筒、鞘液過濾器 Sheath Filter，及空氣濾網(wǎng) Air filter。注意廢液可能有潛在的生物傳染性。進樣管外有一套管，是液滴保留系統(tǒng)的一部分。 2. 細胞 樣品務(wù)必放至 BD FALCON 352052 試管中，否則無法上機。 3. 開啟計算機。 FACS Calibur 關(guān)機 關(guān)機前必要動作： 清洗進樣管和外套管，防止進樣管堵塞、或有染料殘留。 8. 將減壓閥放在「 VENT 漏氣」位置。 （ 2） CD3FITC（ FL1 單染）。 *秘技 2：將減壓閥方向調(diào)在加壓（向前）位置。在顏色方框中點擊 Multicolor Gating（收取樣品時，門內(nèi)細胞將出現(xiàn)顏色）。 FACS101 Handbook 8 – 8. 從屏幕上方 Plots菜單中選擇 Dot Plot功能，可復(fù)制一個同樣大小的散點圖，在出現(xiàn)的對話方框內(nèi)選擇 X軸： FL1H 1024， Y軸： FL2H 1024。儀器設(shè)定文件不能在數(shù)據(jù)收取后再更改，研究人員必須在第一次就使用正確的儀器設(shè)定文件。 13. 從 Cytometer菜單中選擇 Compensation，確認所有預(yù)設(shè)數(shù)值皆為零。調(diào)整定位后，點擊 Acquisition Control 窗口中的 Pause。 在出現(xiàn)的對話方框內(nèi)，將 No Gate 改選 G1=R1。 調(diào)節(jié)熒光補償 說明：最適化的最后一步是調(diào)節(jié)光譜重迭。點擊Acquisition Control窗口中的 Restart。 決定儲存細胞總數(shù) 25. 預(yù)設(shè)之「 儲存細胞總數(shù) 」為 10000。日期為最常用之文件名系統(tǒng)。當(dāng)計算機成功地收取足夠數(shù)據(jù)，會自動儲存數(shù)據(jù)文件 ，并會以“嘟”聲告知， CellQuest會自動升冪附加檔名成。 35. 從屏幕上方 Cytometer 指令欄，選擇 Instrument Setting，出現(xiàn) Instrument Setting窗口。重復(fù)上述程序，樣品架上留約 1 ml DI water 。在實驗文件的空白區(qū)點擊，然后拖動對角線至適當(dāng)大小。刪除 R1區(qū)域后，可用繪圖工具板，重畫 R1。 可以得到該圖之四象限統(tǒng)計結(jié)果。 13. 常規(guī)使用之實驗文件 (內(nèi)含散點圖、圈選區(qū)格、四象限分界、以及統(tǒng)計報告 ) ，我們建議您將它另存新檔 File – Save As，以備后需， 分析其它檔案便輕而易舉。 X 與 Y 參數(shù)項會出現(xiàn)默認值 —FSCH 256 與 SSCH 256，在 Color方框中點擊 Multicolor Gating，確認無誤之后，點擊 OK 便完成了一個 NORM001 的 FSC /SSC散點圖。 6. 點擊 Parameter 鈕來顯示 NORM001 檔案中所有的參數(shù)項，將參數(shù)項改成「 FL2H 256 Gamma2」。在出現(xiàn)方框中命名檔案，并決定欲存放檔案匣，點擊 Save。 狀態(tài)： 顯示儀器運行模式 Not Ready：激光器正在預(yù)熱、鞘液桶空、廢液桶滿。（汰換 Bal seal） 儀器處于 N0T READY 狀況 檢查以下情況： ? 鞘液筒中的鞘液是否用完。 ? 鞘液筒是否漏氣（蓋緊鞘液筒蓋）。 ? 如果 STATUS窗日顯示 READY，則檢查樣本管中細胞濃度是否夠，上樣前是否混勻了。 ? 更換上樣針上部的 O型膠環(huán)。體積 5 公升。體積 5 公升。如果樣本管支撐架位于旁位時，聽不到真空幫浦的工作聲音，可能是真空幫浦停了，關(guān)閉 FACSCalibur，再啟動；移開支撐架時，如果馬達仍然不動，請致電 BD客戶服務(wù)部門尋求幫助。 ? 檢查閾值是否設(shè)置過高，導(dǎo)致無法檢測目標(biāo)細胞群。 ? 上樣針上的 Bal seal是否己磨損。 ? 開機需要 5分鐘時間預(yù)熱。 Standby：儀器在 Standby 狀態(tài)、或儀器在 Run 狀態(tài)而無樣本管在進樣區(qū)上、或支撐架位于側(cè)位、 或樣本管未完全加壓。 12. 對于 存在不同檔案匣之系列檔案，可用鼠標(biāo)以拖曳方式選取所有圖表 (文件中所有圖譜的四角會出現(xiàn)黑色方塊，表示被選擇上 ) ，接著從 Plots菜單選擇 Change Data Files，并在隨后出現(xiàn)之對話方框，選擇所在新目錄與欲分析 檔案 。 7. 從屏幕左列工具板中，選取 Histogram Marker 工具，然后在圖的左緣處點擊并拖曳至定點，一般而 言是陰性信號的右緣。你已完成 R1區(qū)域的界定，我們將以此區(qū)域來圈選淋巴細胞。桌面會出現(xiàn)一 ‘Untitled‘ 實驗文件，可點擊實驗文件的右上角的放大鈕，將實驗文件窗口放大。 10. 點選 四象限統(tǒng)計表， 從屏幕上方 File菜單中選擇 Export Statistics可 輸出統(tǒng)計數(shù)值至 Excel檔案。點擊 X Parameter 鈕來顯示 NORM001 檔案中所有的參數(shù)項 (FSC, SSC, FL1, FL2) 將 X 參數(shù)項改成「 FL1H 256 Gamma1」， Y 參數(shù)項改成「 FL2H 256 Ga