免疫組化、免疫熒光、流式細胞術(shù)的應(yīng)用比較及常見問題分析(完整版)
【正文】 ～ HRP 標記的鏈霉親和素復(fù)合物。 2. 組織芯片應(yīng)用領(lǐng)域 組織芯片的應(yīng)用領(lǐng)域包括與生命科學(xué)相關(guān)的根底研究、臨床研究、應(yīng)用研究和新藥開發(fā)等。免疫組化、免疫熒光、 流式細胞術(shù)的應(yīng)用比較 及常見問題分析 宋硯明 song_yanmingwuxiapptec 第一頁，共三十五頁。 免疫組化染色〔 IHC〕； 原位雜交〔 ISH〕； 熒光原位雜交〔 FISH〕； 原位末端標記分析〔 TUNEL〕； 原位 PCR 以及激光捕獲顯微別離系統(tǒng)輔助的 cDNA雜交。 特點：該法孵育時間短〔通常為 10min〕，靈敏度高以及低背景染色等特點。因此需要普通的酶標二抗即可完成。 試劑盒組成： DAB顯色原〔 20〕〔試劑 A〕 DAB底物緩沖液〔 1〕〔試劑 B〕 3. BCIP/NBT顯色法 產(chǎn)品描述： BCIP/NBT〔 5溴 4氯 3吲哚磷酸 /氮藍四唑〕是一種冷藏穩(wěn)定的、單一組分溶液，用于免疫組化、原位雜交、 western blot、 northern blot和 southern blot，特異性地與堿性磷酸酶〔 AP〕反響生成紫色物質(zhì)。 ?蛋白封閉不充分，建議增加蛋白封閉時間。 ?一抗種屬來源與二抗不匹配，建議實驗前確認一抗的種屬來源。 免疫熒光實驗過程 細胞爬片〔多聚賴氨酸處理，生長密度 7080%〕 細胞固定〔適宜的固定液，如 4%甲醛溶液等〕 細胞膜穿透〔 Triton X100 等〕 封閉〔 3%BSAPBS等〕 一抗孵育 熒光二抗孵育 胞漿 /核襯染〔鬼筆環(huán)肽 /DAPI/PI〕 封片熒光顯微鏡拍照 第十五頁，共三十五頁。 碘化丙啶 (PI)是一種溴化乙啶的類似物，它在嵌入雙鏈 DNA后釋放紅色熒光。 各種熒光染料原理及選擇 第十八頁，共三十五頁。 ?洗滌不充分，建議增加沖洗次數(shù)與時間。 流式細胞術(shù)〔 FLOW CYTOMETRY〕 : 利用流式細胞儀對處于快速流動的細胞或生物顆粒進行多參數(shù)、快速〔每秒可達 100010000個〕的定量分析和分選〔純度可達99%以上〕的技術(shù)。 熒光補償示原理 ?熒光補償是指修正熒光滲漏的過程，如從探測器出去除匹配熒光以外的任何熒光信號。 將 Annexin V進行熒光素〔 FITC、 PE〕或 Biotin標記，以標記了的Annexin VFITC作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。 洗滌不充分，建議增加沖洗次數(shù)與時間。 流式細胞術(shù)常見問題分析 第三十二頁，共三十五頁。封閉不完全，建議增加蛋白封閉時間。進樣速度太快，建議調(diào)低進樣速度。 第三十四頁，共三十五頁。 細胞通透性差，建議增加通透劑的作用時間或濃度。因此將 Annexin V 與 PI 匹配使用，就可以將細胞凋亡早晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開來。然而，熒光染料所發(fā)出的熒光都具有一定的波長范圍〔寬發(fā)射譜性質(zhì)〕，雖然各自的熒光峰值不同，但發(fā)射譜范圍會有一定的重疊。 細 胞 抗原 一抗 二
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