【正文】 上角的放大鈕，將實驗文件窗口放大。你已完成 R1區(qū)域的界定，我們將以此區(qū)域來圈選淋巴細胞。 FACS101 Handbook 17 – 7. 從屏幕左列工具板中，選取 Quadrant Marker 工具，然后在 FL1/ FL2 散點圖中心處點擊并拖曳至定點，一般而言是緊挨著陰性細胞聚落。點擊OPEN。 3. 在 Dot Plot方框中， Plot Source應預設為 Analysis，可 點擊 Select File 鈕，并用隨后之方框來開啟 預 存之 Sample Files，它們的路徑位于 Mac HD： BD Applications： CellQuest Folder： Sample Files。點擊 Select File 鈕，再點擊 Open來開啟 NORM001 檔案。 FACS101 Handbook 21 – 打印報告、輸出統(tǒng)計數(shù)值 9. 從屏幕上方 File菜單中選擇 Print One，可以打印工作中實驗文件。 FACS101 Handbook 22 – 五、錯誤信號、疑難排除 儀器狀態(tài)（ Status）： 在 CELLQuest菜單位于 Cytometer菜單中。旋轉調(diào)整試管支持架（順時鐘向下、逆時鐘向上）。此時，樣本不能良好地進入流動室，無法檢測。如果鞘液筒吸干了，應該重新裝滿鞘液，然后先取下樣品管進行 510次 PRIME，再換上 3ml dH2O上樣管 HI RUN 30分鐘，待鞘液流中的氣泡排除之后，再進行樣本測定。若流動室中存在氣泡，可能使樣本流的位置偏離激光束，導致無細胞信號。體積 20公升。 HydroBios 55?m（信安儀器 0223654317） 。 352052（泛泰公司 0800213029） BD Falcon 352235 試管 附濾網(wǎng) FALCON試管，上機前去除樣品中之細胞團塊，防止管路堵塞。如果未更新，說明儀器與計算機之間的通訊發(fā)生了故障，此時，應關閉計算機和 FACSCalibur，重新打開儀器，繼續(xù)實驗。 儀器訊號噪 聲過高 鞘液過濾器中有氣泡，儀器記錄了氣泡產(chǎn)生的信號，造成了噪聲數(shù)據(jù)的干擾。 儀器處于 STANDBY 狀況（儀器失壓） 如果儀器未加壓，上樣管放好后，雖然控制面板處于 RUN模式，但儀器仍未能達到READY狀況，此時儀器仍處于 STANDBY狀況。 常見故障排除 程序 樣品試管上不去 ? 誤用不適合的試管。可調(diào)整圈選區(qū)域， Markers界限，軟件會重新計算、統(tǒng)計報告。重復前述步驟以增畫另一 Marker，一般而言 M2 始自 M1 的右緣，終于圖的右界。刪除 R1區(qū)域后，可用繪圖工具板，重畫 R1。在實驗文件的空白區(qū)點擊，然后 拖曳 對角線至適當大小。 FACS101 Handbook 18 – 開啟 其它 List Mode Data 11. 如欲接著分析存在同一檔案匣之系列檔案 ，可用鼠標以拖曳方式選取所有圖表 (文件中所有圖譜的四角會出現(xiàn)黑色方塊，表示被選擇上 ) ，接著從 Plots菜單選擇Next Data File，軟件會自動以新檔案來替換現(xiàn)有檔案，您只要確認圈選范圍、與 Quadrant Marker 的位置是否恰當，即可 打印報告、或輸出統(tǒng)計數(shù)值 。 6. 點擊 OK 便完成了一個以 G1 圈選的 FL1/ FL2 散點 圖，可將復制圖移至原圖右方。 X 與 Y 參數(shù)項會出現(xiàn)默認值 —FSCH 256 與 SSCH 256， 在 Color方框 中點擊 Multicolor Gating，確認無誤之后，點擊 OK 便完成了一個 NORM001 的 FSC /SSC散點圖。一般軟件無法打開 list mode數(shù)據(jù)文件，需藉助如 CellQuest, WinList, WinMDI, 等 Flow 分析軟件 ，才可開啟、繪圖、并進行分析統(tǒng)計。 36. 檢品分析完畢后，用鼠標從屏幕上方 Acquire 指令欄中，選取 Disconnect to Cytometer 以斷絕計算機與儀器間之聯(lián)機。 FACS101 Handbook 14 – ： 32. 不建議長期使用硬盤儲存數(shù)據(jù) 數(shù)據(jù)，可考慮以燒光盤 （如配有 CDRW）、口袋硬盤（ Flash Drive）來備份大量實驗數(shù)據(jù)，以免占用原有硬盤的內(nèi)存， 影響數(shù)據(jù)處理速度。 計數(shù)器 Counters 29. 從 Acquire 菜單中選擇 Counters. 窗口會顯示樣品分析速率、與總數(shù)進度 。 從 Acquire 菜單中選擇 Parameter Description，出現(xiàn) Parameter Description對話方框。當您已完成 2色熒光之光譜重迭時，點擊 Acquisition Control窗口中的 Pause、 Abort。調(diào)節(jié) FL2%FL1使 FITC陽性細胞在 FL1/FL2散點圖的右下象限。 FACS101 Handbook 11 – 19. 在 Threshold 窗口，適當?shù)靥岣?FSC閾值 52， 以去除碎片或低階 噪音。分析樣品時，區(qū)域內(nèi)細胞應會呈現(xiàn)成紅色，可移動或改變形狀來圈選有意義的細胞。 調(diào)節(jié) FSC/SSC探測器（電壓） 15. 觀察 FSC/SSC圖的變化。出現(xiàn) Detectors/Amps窗口。 建立儀器和計算機之間通訊 10. 從 Acquire菜單中選擇 Connect to Cytometer，此時會出現(xiàn) Acquisition Control 對話方框。在圖中，橫坐標 X軸 為為熒光 1強度的相對值，單位是道數(shù)，縱坐標 Y軸則 通常表示熒光 2或光散射強度的相對值。 FACS101 Handbook 7 – 5. 從工具板中點擊散點圖圖示。 *秘技 1：如順序相反，儀 器和計算機之間無法建立正常通訊，無法執(zhí)行 ―connect to cytometer”。 10. 關閉計算機。 4. 取 2 ml dH2O，重復上述步驟 13。 7. 排除液流管路與過濾器中的氣泡。研究生可至本公司網(wǎng)站下載 染色 方法 ? 直接免疫熒光染色 ? Lysed No Wash Procedure ? Lysed And Wash Procedure, SimulTEST amp。當支撐架位于左側或右側位置時，真空幫浦就會啟動，將液體從外管吸入廢液筒內(nèi)。 ? 空氣過濾網(wǎng)：用于過濾冷卻雷射的空氣。筒上裝有液面感應器，鞘液用完時，儀器軟件上會有顯示。） ? STANDBY： 無樣品或暖機時之正常位置，此時鞘液停止流動，雷射功率自動降低。FACS101 Handbook 1 – BD FACSCalibur流式細胞儀 FACS101 Handbook 本課程介紹「表面抗原流式分析」有關之基礎工作原理。（正常顯示綠色；黃色時表示儀器不正常，請檢查是否失壓。裝八分滿鞘液筒，儀器可以運行大約 3小時。在鞘液筒添加鞘液時，需要減壓。 液滴存留系統(tǒng)：系統(tǒng)由支撐架、真空幫浦和外套管組成。表面抗原熒光染色的 方法大致有兩種： 直接免疫熒光、間接免疫熒光染色。 6. 將減壓閥方向調(diào)在加壓（ Pressurize）位置。 3. 按 Standby，取下樣品管，執(zhí)行 PRIME功能兩次。確認退出計 算機中所有 BD應用軟件，所有數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)已儲存?zhèn)浞荨? Calibur 開機 1. 先開啟細胞儀本體再打開計算機。桌面會出現(xiàn)一 ‘Untitled‘ 實驗文件，可點擊實驗文件的右上角的放大鈕，將實驗文件窗口放大。 7