【正文】 FACS101 Handbook 1 – BD FACSCalibur流式細胞儀 FACS101 Handbook 本課程介紹「表面抗原流式分析」有關之基礎工作原理。如希望進一步了解流式細胞技術應用，請至本公司網站訂閱 FACSinformation電子報 。 如需要本課程手冊，歡迎至本公司網站下載 。 如需要 免疫 熒光染色 方法， 請至本公司網站下載 。 一、 BD FACSCalibur 基本結構 ： 1. 電源開關：在 BD FACSCalibur儀器右側下方，先啟動儀器本體，再打開 計算機。 2. 光學系統(tǒng)： BD FACSCalibur 基本配有一支波長 488 nm 的氬離子雷射 以 BD FACSCalibur 基本型為例 ? FSC Diode 只收 488 nm波長散射光 ? SSC PMT 只收 488 nm波長散射光 ? FL1 PMT 熒光光譜峰值落在綠色范圍（波長 515545 nm） ? FL2 PMT 熒光光譜峰值落在橙紅色范圍（波長 564606 nm） ? FL3 PMT 熒光光譜峰值落在深紅色范圍（波長 650 nm） FACS101 Handbook 2 – 3. 儀器面板： 儀器前方面板的右下方有三個流速控制鍵、及三個功能控制鍵。 流速控制 ： LO： 樣品流速： 12 ?l /min MED：樣品流速： 35 ?l /min HI: 樣品流速： 60 ?l /min 功能控制 ： ? RUN：此時上樣管加壓，使細胞懸液從進樣針進入流動室。（正常顯示綠色；黃色時表示儀器不正常，請檢查是否失壓。） ? STANDBY： 無樣品或暖機時之正常位置，此時鞘液停止流動，雷射功率自動降低。 ? PRIME：去 除流動室中的氣泡，流動室施以反向壓力，將液流從流動室沖入樣品管，持續(xù)一定時間后，以鞘液回注滿流動室。 PRIME 結束，儀器恢復 STANDBY狀態(tài)。 4. 儲液箱抽屜： 在主機左下方之儲液箱抽屜。可向前拉開，內含鞘流液筒、廢液筒、鞘液過濾器 Sheath Filter，及空氣濾網 Air filter。請注意氣路減壓閥 VENT TOGGLE之位置。 FACS101 Handbook 3 – ? 鞘液筒：位于抽屜左側，容積 4升。裝八分滿鞘液筒，儀器可以運行大約 3小時。筒上裝有液面感應器，鞘液用完時，儀器軟件上會有顯示。鞘液筒蓋上有金屬 環(huán)扣，保證鞘液筒密閉。 ? 廢液筒：位于抽屜右側，容積 4升。筒上裝有液面感應器，廢液盛滿時，儀器軟件上會有顯示。注意廢液可能有潛在的生物傳染性。 ? 鞘液過濾器： ?m過濾器，去除鞘液中的雜質，保證進入流動室的鞘液是干凈的。 ? 氣路減壓閥：沿箭頭方向移動閥門開關，鞘液筒減壓，氣壓恢復正常。在鞘液筒添加鞘液時，需要減壓。 ? 空氣過濾網：用于過濾冷卻雷射的空氣。 5. 上樣品區(qū)： 上樣品區(qū)是樣本管的上樣位置。它包括三個部分，一個是進樣針 Sample Injection Tube，將樣本輸入流動室，還 有就是支撐架 Tube Support Arm、和液滴存留系統(tǒng) Droplet Containment System。 ? 進樣針：是一根不銹鋼管，將細胞從樣本針中吸入流動室。進樣管外有一套管，是液滴保留系統(tǒng)的一部分。 ? 支撐架：用于支撐樣本管、并負責啟動液滴存留系統(tǒng)。支撐架有三個位置：位于樣本管之下的中位，樣本管左側或右側。 液滴存留系統(tǒng)：系統(tǒng)由支撐架、真空幫浦和外套管組成。當支撐架位于左側或右側位置時，真空幫浦就會啟動，將液體從外管吸入廢液筒內。上樣時，須注意將支撐架位于中位，以避免過多樣品被抽吸 到廢液筒內（當支撐架位于中位，真空幫浦停止工作）。更換樣品時，讓儀器保持 RUN的模式，使得進樣針可以反沖；切換到STANDBY模式前，確保液路已沖洗徹底以免碎片沈積到流動室中。 FACS101 Handbook 4 – Macintosh計算機與打印機： 準備您的細胞樣品 1. 理想樣品濃度調至 110 X 105 cells/ml？一般實驗只需 ml的 樣品。 2. 細胞 樣品務必放至 BD FALCON 352052 試管中，否則無法上機。 3. 上機前務必去除樣品中之細胞團塊，以防止管路堵塞？可使用 附濾網 BD FALCON試管 (Cat. ) 或 3555 ?m的尼龍篩網 。 4. 供流式分析的樣品是單細胞懸浮液，而且大部分樣品都需經熒光染色。表面抗原熒光染色的 方法大致有兩種： 直接免疫熒光、間接免疫熒光染色。研究生可至本公司網站下載 染色 方法 ? 直接免疫熒光染色 ? Lysed No Wash Procedure ? Lysed And Wash Procedure, SimulTEST amp。 HLAB27 ? Peripheral Blood Mononuclear Cell Procedure ? Leukemia and Lymphoma Procedure 1 ? Leukemia and Lymphoma Procedure 2, Bcell Clonality Assay ? 間接免疫熒光染色 ? 滴定抗體濃度 ? 常用試劑 5. 如因特殊因素無法下載上述實驗 方法，請 ： 或 。 FACS101 Handbook 5 – 二、開機、關機標準操作 FACS Calibur 開機 1. 開啟細胞儀電源。 2. 開啟其它周邊配備電源，如打印機及 MO機。 3. 開啟計算機。 4. 確認鞘流液筒有八分滿的 FACS Flow，確實旋緊 (鞘液筒容量為 4L)。 5. 將廢液倒 掉，并在廢液筒中加入 200 ml 家用漂白水 (廢液筒容量為 4L)。 6. 將減壓閥方向調在加壓（ Pressurize）位置。 7. 排除液流管路與過濾器中的氣泡。 8. 取下樣品管，執(zhí)行 PRIME 功能兩次。 9. 使用 1ml PBS， HIGH RUN 兩分鐘。 10. 可開始分析樣品。 FACS Calibur 關機 關機前必要動作： 清洗進樣管和外套管，防止進樣管堵塞、或有染料殘留。 1. 將樣品支持架左移，取 2 ml FACSClean（ 10%Bleach）上樣品，讓儀器的真空系統(tǒng)抽取約 1 ml 的液體。 2. 將樣品支 持架回正，按 HI RUN，然后讓 FACSClean 清洗管路 10分鐘。 3. 按 Standby，取下樣品管，執(zhí)行 PRIME功能兩次。 4. 取 2 ml dH2O，重復上述步驟 13。 5. 注意最后只留約 1 ml dH2O 在試管中。 6. 按 STANDBY 五分鐘，使風扇冷卻雷射后，關閉細胞儀（必要動作，以保護雷射光源。） 7. 倒掉廢液，并回填 200 ml漂白水。 8. 將減壓閥放在「 VENT 漏氣」位置。將鞘流液筒充填至八分滿。 9. 退出軟件“ File” ?“ Quit” (如有對話選項，選擇“ Don?t save” )。確認退出計 算機中所有 BD應用軟件，所有數據數據已儲存?zhèn)浞荨? 10. 關閉計算機。“ Special” ?“ Shutdown”。 FACS101 Handbook 6 – 三、上機分析流程 建議首次試機避免進行大量試驗，僅需準備下列樣品。 （ 1） Negative Control（不加任何抗體）。 （ 2） CD3FITC（ FL1