流式細胞術(shù)在哺乳動物精液質(zhì)量檢測中的應(yīng)用(存儲版)
【正文】 ptosis etc, provide us valuable information regarding sperm function. New fluorescent probes and techniques are continuously being developed. FCM offers powerful tools and exciting opportunities for improving our ability to accurately evaluate semen quality.Key words: Flow cytometry。流式細胞術(shù)在哺乳動物精液質(zhì)量檢測中的應(yīng)用* 基金項目：國家自然科學(xué)基金（39970117）；中國科學(xué)院重大項目（KZ952J1109）采克俊1,2，司 維1,2，李亞輝1,2,3，季維智1,4 通訊作者（Corresponding author）,Tel: 08715139413, Email: wji,（，云南 昆明 650223。 Spermatozoa。這兩種信號同時被前向的光電二極管和側(cè)向的光電倍增管接收，經(jīng)計算機處理，細胞的一系列特性就被快速準確地測定。它們是膜不透性的DNA探針，只有質(zhì)膜破損的精子，染料才能進入細胞與DNA結(jié)合。 Johnson，1995）。Hoechst 33342是一種膜通透性活體染料，死精子和活精子都標記，而PI只標記死精子。因此檢測精子的頂體狀態(tài)，有助于反映精子的受精能力。FITCPNA檢測頂體反應(yīng)有兩種樣品處理方法：①樣品需要固定，F(xiàn)ITCPNA才能穿過質(zhì)膜和頂體外膜，標記頂體。凝集素對精子有一定毒性，染色時間不宜過長。3 檢測精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)完整性精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)完整性對于精確傳遞遺傳物質(zhì)至關(guān)重要。通過熱處理，來自低生育力的牛、小鼠和人精子的染色質(zhì)更容易變性（Evenson et al，1980）；采用酸變性處理對人和動物精液的研究得到相同的結(jié)論(Evenson et al,1999，2000；Bochenek et al，2001)。）％，P＝]；認為如果精子的COMPαt179。小鼠睪丸若暴露于高于正常生理溫度的環(huán)境中，會損傷精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)完整性，這一指標比精子頭部形態(tài)檢測更靈敏（Sailer et al,1997）。JC1在檢測精子線粒體膜電位方面具有重要作用：在精子線粒體膜電位低時，以單體形式存在，發(fā)綠色熒光；當膜電位高時，形成J聚體，發(fā)橙色熒光。發(fā)現(xiàn)精子攝取R123到達平衡的速度較快，只需10min；R123陽性率與精子活動性相關(guān)，反映線粒體的功能變化。而FCM被認為是當今檢測凋亡最敏感、最可靠的手段。精子冷凍后其Annexin V陽性率明顯升高，并同精子的不同運動參數(shù)高度相關(guān)。Gadella et al(2002)發(fā)現(xiàn)，豬精子獲能后可檢測到高水平的PS,但TUNEL法檢測無顯著變化，推測精子不出現(xiàn)凋亡。該方法與血球計數(shù)儀檢測相比，變異性很小。精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)檢測是預(yù)測精子生育力的最佳指標，這一方法在人類輔助生殖技術(shù)和家畜生殖工程中得到了重視和推廣，且樣品可冷凍待測，運輸方便，使SCSA應(yīng)用非常靈活。陽性為死精子，雙陽性處于從活到 Region G為活精子（CFDA+/PI）； 左下角為雜質(zhì)。 圖8 JC1/PI雙標記檢測精子線立體功能。圖10 TUNEL檢測精子凋亡。 選出精子?？煞譃樗娜海篗ero +/Yopro –分為四群：FITCPNA+/PI – 為頂體反應(yīng)的活精子； 為獲能的活精子；Mero +/Yopro I +為獲能的死精子；FITCPNA+/PI +為頂體受損的死精子；FITCPNA–/PI Mero–/Yopro –為未獲能的活精子；Mero–/Yopro +為死精為頂體完整的活精子；FITCPNA–/ PI +為頂體完整 子的死精子。 圖1：SYBR14陽性為活精子，PI 圖2：CFDA/PI雙標記測精子活力。FCM的優(yōu)點是可以快速地同時測定多個指標；只有樣品中的顆粒被檢測，不必洗掉游離的染料；大多數(shù)試驗也不需要固定，這種方法很適合自然狀態(tài)下的精子的檢測。Evenson et al(1993)曾經(jīng)介紹過一種用AO或PI標記精子DNA，結(jié)合已知濃度的標準熒光微球來計算牛精子濃度的方法。Sun et al（1997）用TUNEL法檢測人精子DNA的片斷化，發(fā)現(xiàn)DNA的片斷化與精子活動率、正常形態(tài)、精子濃度、體外受精率、胚胎發(fā)育率成反比；吸煙者比不吸煙者精子DNA的片斷化比例要高。兩種方法相比，Annexin V /PI聯(lián)染法樣品不需固定，更方便易行。5 檢測精子凋亡盡管精子作為一種終端的不能分裂的細胞，是否存在凋亡目前尚無定論。線粒體特異的熒光探針經(jīng)常和檢測精子活力的探針同時使用。R123可檢測精子線粒體有無功能，但不能區(qū)別線粒體膜電位的高低。Kobayashi et al（2001）發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)癌癥患者精子的DNA損傷普遍存在，αt、COMPαt值顯著高于正常對照組。Larson et al（2000）對SCSA在體外受精（IVF）和胞質(zhì)內(nèi)單精注射（ICSI）妊娠結(jié)果的預(yù)測效果進行了研究，發(fā)現(xiàn)7例妊娠成功者與14例妊娠失敗者相比，其精子的COMPαt值差異顯著[（177。用PI染色來檢測精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)完整性報道的還較少，實驗方法還不統(tǒng)一，提供
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