20xx年醫(yī)學(xué)專題—流式細(xì)胞術(shù)檢測人和小鼠細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子方法的建立(存儲版)
【正文】 rine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokines activities and secreted proteins. J Immunol 1986。各種濃度的PMA刺激后均不能有效的區(qū)分CD4陰性和CD4陽性細(xì)胞，而CD3和CD8的表達受影響很小，可以有效的區(qū)分陰性和陽性細(xì)胞。D為以“R1 and R3”設(shè)門，IL4和IFNγ的散點圖。A為FSC和SSC的散點圖，R1區(qū)為淋巴細(xì)胞區(qū)；B為CD3和CD8的散點圖，R2區(qū)為Th細(xì)胞（CD3＋CD8－），R3區(qū)為Tc細(xì)胞（CD3＋CD8＋）。74(3):20710 BCA圖1 10ng、20ng、50ng PMA和500ng/ml Ionomycin共同刺激4h后人外周血T淋巴細(xì)胞CDCD8和CD3的表達。由于T淋巴細(xì)胞表達的因子非常多，檢測其它細(xì)胞因子可以參照檢測IL4和IFNγ的方法進行。目前，國內(nèi)一些流式細(xì)胞儀型號相對落后，不能進行4色染色標(biāo)記技術(shù)，筆者認(rèn)為可以采用雙管標(biāo)記檢測法，即采用CDCD8和IFNγ3色標(biāo)記一管用于檢測Th1細(xì)胞；采用CDCD8和IL4 3色標(biāo)記一管用于檢測Th2細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)在PMA的刺激后4h，IFNγ和IL4的表達就達到一個較高的水平，因而適合進行流式檢測。采用CD3+CD8的T淋巴細(xì)胞為Th細(xì)胞，設(shè)門分析Th1細(xì)胞（IFNγ+）和Th2細(xì)胞（IL4+）的百分比。10ng、20ng和50ng的PMA刺激后4h，CD4的表達明顯下降，已經(jīng)不能區(qū)分出CD4陽性T淋巴細(xì)胞，而CD8和CD3的表達未受明顯影響。5 流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠外周血Th1和Th2細(xì)胞。實驗管加入IFNγFITC、IL4 PE各5ul，對照管加入同型對照抗體，4℃避光孵育30min。采用抗小鼠CD4CYC、CD8PE抗體標(biāo)記T淋巴細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測CD4和CD8的表達。加入紅細(xì)胞裂解液（FACS Lysing Solution）1ml裂解殘余紅細(xì)胞，2ml PBS洗滌細(xì)胞一次。將外周血以等體積Hanks液稀釋后，輕輕加入淋巴細(xì)胞分離液上層。GolgiStop（內(nèi)含Monensin ，BD Pharmingen）Cytofix/Cytoperm液、Perm/Wash液和FACS Lysing Solution，均購自BD Pharmingen。Th1/Th2 細(xì)胞首先是CD4+ T淋巴細(xì)胞。目前檢測的主要方法有酶聯(lián)免疫法、ELISPOT法、熒光定量法及原位雜交等方法。Th1細(xì)胞主要分泌ILIL1IFNγ和TNF α等細(xì)胞因子，介導(dǎo)與細(xì)胞毒和局部炎癥有關(guān)的免疫應(yīng)答，參與細(xì)胞免疫及遲發(fā)型超敏反應(yīng)。由于未活化的淋巴細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子極少，用流式細(xì)胞儀很難檢測出來，因此在檢測前需刺激活化。工作液：貯存液1:100 稀釋于RPMI 1640培養(yǎng)基中，此時為1181。細(xì)胞內(nèi)因子抗體：抗人IL4PE, IFNγFITC。棄去上清， RPMI 1640培養(yǎng)基（含10% 小牛血清，50 μg/ml penicillin
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